人工植物微染色體制造技術

描述了包含能特異性結合著絲粒蛋白C(CENPC)的功能性著絲粒的人工植物微染色體以及所述微染色體的制備方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物生物工程領域，具體地講，涉及人工微染色體以及在植物中制備這類微染色體的方法。
技術介紹
目前在染色體工程上的進展使得改變植物基因組成為可能，因此可改變其表型。當轉基因整合到植物基因組時，通常是以隨機方式，而且拷貝數無法預知。因此，研究工作直接針對更好地控制轉基因整合。如果有這樣的需要，研究人員想知道答案是否在于使用人工微染色體。它們是由順式作用(cis-acting)DNA序列元件構建的人工制備的線狀或環狀DNA分子,所述序列元件可提供所構建微染色體的復制和分配。據信，人工染色體的產生將會減少或消除與隨機基因組整合到天然植物染色體相關的問題，例如因轉基因與宿主植物基因組材料結合而造成的連鎖拖曳(linkage drag)。人工染色體也可提供比標準轉化載體多10-100倍的基因的遞送方法，并提供大染色體區段，用于互補和/或基于圖譜的克隆。對于人工染色體復制、穩定性和維持/遺傳，已經鑒定出3種組分:(i)作為復制起點的自主復制序列；(ii)起到穩定和維持線狀染色體末端作用的端粒，(iii)作為動粒裝配位點的著絲粒，用于有絲分裂和減數分裂中染色體的適當分離。來自單細胞生物(例如酵母)的分離著絲粒在高等真核生物中不起作用。美國專利5，270，201 (1993年12月14日授予Richards等人)描述了基于端粒和任選著絲粒的植物人工染色體。美國專利7，119，250(2006年10月10日授予Luo等人)描述了植物著絲粒的組成。美國專利7，132，240 (2006年11月7日授予Richards等人)描述了從任何生物的著絲粒中有效分離甲基化著絲粒DNA的可行方法。美國專利7，193，128 (2007年3月20日授予Copenhaver等人)描述了用植物著絲粒的核酸序列來產生或增加作物收益的方法。2007年3月15日公布的公布號為W02007/030510的PCT申請描述了用自主微染色體轉化植物的制備方法。專利技術概沭 本專利技術涉及包含功能性著絲粒的人工植物微染色體，其包含:(a)至少2個反向CentC串聯重復序列陣列，其中第I陣列包含至少50個拷貝的CentC，第2陣列包含至少50個拷貝的CentC ;和(b)至少一個拷貝的反轉錄轉座元件，其中反轉錄轉座元件位于第I陣列和第2陣列之間。在第2個實施方案中，本專利技術的人工植物微染色體包含選自CentA、CRMl和CRM2的反轉錄轉座元件。在第3個實施方案中，本專利技術的人工植物微染色體還包含至少一個功能性端粒。在第4個實施方案中，人工植物微染色體所包含的功能性著絲粒與著絲粒蛋白C(CENPC)特異性結合。在第5個實施方案中，玉米植物(corn plant)可包含任何本專利技術的人工微染色體。在第6個實施方案中，本專利技術涉及包含功能性著絲粒的人工植物微染色體，其中著絲粒與著絲粒蛋白C(CENPC)特異性結合。在第7個實施方案中，本專利技術涉及分離的多核苷酸，其包含:(a)至少2個反向CentC串聯重復序列陣列，其中第I陣列包含至少10個拷貝的CentC，第2陣列包含至少10個拷貝的CentC ;和(b)至少一個拷貝的反轉錄轉座元件，其中反轉錄轉座元件位于第I陣列和第2陣列之間。在第8個實施方案中，本專利技術的分離多核苷酸包含選自CentA、CRMl和CRM2的反轉錄轉座元件。在第9個實施方 案中，本專利技術涉及分離的多核苷酸，其包含:(a)至少一個CentC串聯重復序列陣列，該陣列包含至少10個拷貝的CentC;和(b)至少一個拷貝的選自CentA、CRMl和CRM2的反轉錄轉座元件。在第10個實施方案中，本專利技術涉及分離的多核苷酸，其包含:(a)至少一個CentC串聯重復序列陣列，該陣列包含至少10個拷貝的CentC ;和(b)CentA、CRMl和CRM2各自至少一個拷貝。在第11個實施方案中，本專利技術涉及重組構建體以及包含這類重組構建體的轉基因玉米植物，所述構建體包含本專利技術的分離多核苷酸。在第12個實施方案中，本專利技術涉及包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體的轉基因玉米植物的制備方法，所述方法包括:(a)使至少一個玉米植物細胞與包含本專利技術重組構建體的混合物接觸；(b)鑒定來自步驟(a)并包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體的至少一個玉米植物細胞；和(C)使來自步驟(b)的玉米植物細胞再生出能育的玉米植物，其中所述玉米植物包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體。所述混合物還可包含編碼用于刺激細胞生長的多肽的多核苷酸，其中該多肽選自wuschel、baby boom、RepA或Lecl。附圖簡沭本專利或申請文件包括至少一幅彩色附圖。如有需要并支付必要費用后，專利辦公室將會提供帶彩圖的本專利或專利申請公布說明書副本。根據作為本申請組成部分的以下詳述和附圖及序列表，可以更全面地理解本專利技術。附圖說明圖1.來自H1-1I轉化CMC3庫I事件#14的玉米胚胎發生愈傷組織(embryogeniccalli)的有絲分裂染色體鋪片(spread)的熒光原位雜交(FISH)。愈傷組織源自用Tn5_3改型(retrofit)的線性化BAC克隆庫I轉化的未成熟胚。前中期(左)和中期(右)核都顯示出20條天然染色體和I條微染色體(箭頭和插圖)。這兩種微染色體對CentC(綠色一顏色；白色一灰度)著絲粒特異性重復序列和對轉化構建體具有特異性的獨特標記探針23715(紅色一顏色；白色一灰度)都呈陽性，其中CentC和23715基本上共同定位(colocalize)于微染色體(插圖)。圖2.來自H1-1I轉化CMC3庫I事件#14的玉米胚胎發生愈傷組織的有絲分裂染色體鋪片的FISH。愈傷組織源自用Tn5-3改型的線性化BAC克隆庫I轉化的未成熟胚。圖A顯示中期核，顯示出20條天然染色體和2條微染色體(方框)。這兩種微染色體對CentC (綠色一顏色；白色一灰度)著絲粒特異性重復序列和對轉化構建體具有特異性的獨特標記探針23715 (紅色一顏色；白色一灰度)都呈陽性。圖B-D是該方框的更高放大倍數圖，顯示出微染色體(箭頭)，其中:B-RDAPI ;C-DAPI+23715探針(紅色一顏色；白色一灰度);和D-DAPI+CentC探針(綠色一顏色；白色一灰度)。圖3.來自H1-1I轉化CMC3庫I事件#14的玉米胚胎發生愈傷組織的有絲分裂染色體鋪片的免疫熒光。愈傷組織源自用Tn5-3改型的線性化BAC克隆庫I轉化的未成熟胚。圖A顯示中期核，顯示出20條天然染色體和I條微染色體(箭頭)。天然染色體和微染色體的所有著絲粒對著絲粒蛋白C(即CENPC，一種著絲粒/動粒特異性蛋白)(紅色一顏色；白色一灰度)都呈陽性。圖B-C是微染色體的更高放大倍數圖，其中=B-RDAPI ;和C-DAPI+CENPC(紅色一顏色；白色一灰度)。CENPC的形態和免疫學定位表明，微染色體由各自具有功能性著絲粒的兩條姊妹染色單體組成。圖4.圖A-來自H1-1I轉化CMC3庫I事件#14的玉米胚胎發生愈傷組織的有絲分裂染色體鋪片的免疫熒光。愈傷組織源自用Tn5-3改型的線性化BAC克隆庫I轉化的未成熟胚。在分裂后期觀察到天然染色體和微染色體(方框)的姊妹染色單體分離。天然染色體和微染色體的所有著絲粒對著絲粒蛋白C(即本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于制備包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體的轉基因玉米植物的方法，所述方法包括：(a)使至少一個玉米植物細胞與下述混合物接觸，所述混合物包含具有相反方向CentC重復序列的、庫化的著絲粒特異性的BAC組或單個的BAC克隆；(b)鑒定來自步驟(a)并包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體的至少一個玉米植物細胞；所述的著絲粒具有至少2個反向CentC串聯重復序列陣列；和(c)使來自步驟(b)的玉米植物細胞再生出能育的玉米植物，其中所述玉米植物包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體。

【技術特征摘要】
2006.05.17 US 60/801,0041.一種用于制備包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體的轉基因玉米植物的方法，所述方法包括: (a)使至少一個玉米植物細胞與下述混合物接觸，所述混合物包含具有相反方向CentC重復序列的、庫化的著絲粒特異性的BAC組或單個的BAC克隆； (b)鑒定來自步驟(a)并包含具有功能性著絲粒的人工植物微染色體的至少一個玉米植物細胞；所述的著絲粒具有至少2個反向CentC串聯重復序列陣列；和 (c)使來自步驟(b)的玉米植物細胞再生出能育的玉米植物，其中所述玉米植物包含具有功能性著絲粒的人工植...

【專利技術屬性】
技術研發人員：E阿納尼伊夫，MA錢伯林，WJ戈頓坎姆，S斯維塔舍，吳成倉，
申請(專利權)人：先鋒高級育種國際公司，
類型：發明
國別省市：