一種適合于雙向電泳的大小鼠睪丸組織樣品全蛋白提取和分離的方法技術

本發明專利技術公開了一種適合于雙向電泳的大小鼠睪丸組織樣品全蛋白提取和分離的方法，包括大小鼠睪丸組織處理、睪丸組織全蛋白樣品制備方法、雙向電泳技術體系、凝膠的染色和圖譜分析，本發明專利技術方法將繁瑣的、穩定性較差的通用雙向電泳技術體系進行了優化，大大減少了摸索條件的時間和試劑消耗，節省了實驗成本，獲得了滿意的便于后續分析的雙向電泳圖譜，較目前通用的勻漿液提取法、裂解液提取法、裂解液提取/丙酮沉淀法更適合大小鼠睪丸組織蛋白樣品的提取，在不增加試劑成本的前提下，不僅減少了蛋白的降解，而且增加了蛋白的溶解性，從而獲得蛋白點較多且清晰水平條紋，重復性較好的雙向電泳圖譜。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種適合于雙向電泳的大小鼠睪丸組織樣品全蛋白提取和分離的方法，其步驟如下：（1）將實驗大小鼠放入盛有乙醚的箱內，待其窒息后，固定于解剖盤，切開陰囊，剝離其周圍組織，摘除睪丸，并用超純水沖洗，然后去除被膜，稱重；（2）將（1）處理的睪丸組織與預冷的組織樣品蛋白裂解液以質量體積比為1:5的比例混合后，電動組織勻漿儀11,000?rpm勻漿，每次10s,間隔1min,連續3?5次，直至體系呈均質狀懸濁液，整個過程樣品管始終置于冰浴中；（3）將（2）處理后的懸濁液在室溫下靜置1h，使蛋白充分溶解，然后在4℃、16000g離心1?h，然后吸取上清液，用Bradford法測定得上清液的蛋白濃度，根據測定結果將上清液按體積分裝3?4份，使每份上清液的蛋白含量保持至400?500ug；?（4）將（3）所得上清液與5倍體積的80%預冷丙酮混勻，?18―?20℃放置15min－60min；（5）將（4）處理液在4℃、16,000g離心5min，棄去上清，置于超凈工作臺中正置,?微風吹拂10s?30s，得待溶解的沉淀蛋白樣品；（6）取?20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液1ml置1.5ml?EP管中，室溫溶解后，加入0.01g?DTT,?2.5mL?Bio?Lyte?4?6，2.5mL?Bio?Lyte?5?7，充分混勻，取出400ml，加入（6）得沉淀蛋白樣品中，充分溶解，混勻；（7）用移液搶將（6）得到的蛋白樣品從左至右沿著邊緣線性加入到聚焦盤中，保持槽中間的樣品液連貫，槽兩端各留1－1.2cm距離，同時，在聚焦盤電極的兩側分別放置鹽橋，并用10uL的超純水浸濕，然后將水化好的膠條轉入聚焦盤中，膠面朝下，正負極對應，沿著每根膠條上緩慢的加入2?3mL礦物油，與聚焦槽的正負極對好，蓋上蓋子；（8）將（7）處理后的膠條，進行等電聚焦，設置等電聚焦程序為：S1?250V?線性30min，S2?1000V?快速1h，S3?10000V?線性5h，S4?10000V?快速60,000伏小時，?S5?500V快速任意時間；?（9）將（8）聚焦程序結束后，立即分別用膠條平衡緩沖液Ⅰ和膠條平衡緩沖液Ⅱ進行膠條平衡，平衡緩沖液按5ml/gel加入，平衡時間為12?15min；（10）將（9）聚焦后的膠條立即進行第二向SDS?PAGE電泳，步驟為：配制12%的丙烯酰胺凝膠,每塊凝膠用凝膠液40?42ml，注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用水飽和正丁醇封面，保持膠面平整，聚合30分鐘，在電泳槽加入1×電泳緩沖液后，接通電源，起始時用16mA/gel/17cm的低電流，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流至24?30mA/gel/17cm，持續5.5－6小時,即可停止電泳；?(11)取出（10）處理后的凝膠進行考馬斯亮藍G?250染色，染色好凝膠放入透射掃描儀中掃描，制圖，并用專用分析軟件進行分析。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張建海，羅廣營，牛瑞燕，王金明，孫子龍，王俊東，
申請(專利權)人：山西農業大學，
類型：發明
國別省市：