利用酶聯免疫斑點法的結核效應T淋巴細胞檢測方法技術

利用酶聯免疫斑點法的結核效應T淋巴細胞檢測方法，步驟包括：采集肝素鋰抗凝外周血；離心后，吸取中間云霧狀的單個核細胞層到離心管；離心后，棄去上清液，加入RPMI1640離心；棄去上清液，加入AIM-V培養液；制備稀釋細胞工作液：向培養板中加入AIM-V培養液、抗原A、抗原B、陽性對照；用無菌PBS洗滌4遍，再以蒸餾水沖洗終止反應，放室溫干燥培養板，用放大鏡觀察結果，進行斑點計數。本發明專利技術通過離心吸取紅細胞與血漿之間的白細胞層提高淋巴細胞的數量，從而對抗凝全血中單個核細胞的收集做到最大效應的收集，顯著提高了結核篩查的臨床診斷應用效率和范圍。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
利用酶聯免疫斑點法的結核效應T淋巴細胞檢測方法，其特征在于，步驟包括：A．采集肝素鋰抗凝外周血4?8ml，在1600?1800r/min離心28?30min；向裝有平衡至室溫的4ml的RPMI1640的15ml離心管中倒入4ml肝素鋰抗凝外周血，混勻；按照2?3:1的比例小心將上述血樣加在4ml的Ficoll淋巴細胞分離液上層，確保上述血樣與所述Ficoll淋巴細胞分離液不混合；然后在18℃以2280r/min離心22min；B．離心后，吸取中間云霧狀的單個核細胞層到15ml離心管中，加入RPMI1640至10ml，混勻，在18℃以1780r/min離心7min；C．離心后，棄去上清液，加入1ml的RPMI1640輕緩重旋沉淀，再加入RPMI1640至10ml，混勻，在18℃以1350r/min離心7min；D．離心后，棄去上清液，加入0.5?1ml的AIM?V培養液輕緩重旋沉淀制成樣品細胞懸液；E．制備稀釋細胞工作液：在1.5ml離心管中加入10μl樣品細胞懸液和40μl的0.4%的臺酚蘭，混勻，取10μl臺酚蘭和樣品細胞懸液的混合物加入血細胞計數板中計算每ml的樣品細胞懸液的細胞數量，計數4×4大格含0.1μl樣品；然后計算細胞稀釋需要的體積，并加入AIM?V無血清培養液；按照公式：需要的樣品細胞懸液量=（每個培養孔需要加入的細胞數量×10?5×需要使用的稀釋細胞工作液量）/（每ml的樣品細胞懸液的細胞數量×10?6）；每ml的樣品細胞懸液的細胞數量=細胞計數×稀釋倍數×104；需要使用的稀釋細胞工作液量=需加入的孔位數×100μl＋100μl；AIM?V無血清培養液量=需要使用的稀釋細胞工作液量?需要的樣品細胞懸液量；F．向培養板中加入AIM?V培養液、抗原A、抗原B、陽性對照各50μl至培養板中的陰性對照孔、抗原A孔、抗原B孔、陽性對照孔中，再往上面4孔中分別加入100μl稀釋細胞工作液，放在37℃的CO2培養箱孵育16?20h；G.試劑平衡至室溫，用無菌PBS按1:200配制酶標抗體工作液，現配現用，即酶標抗體工作液=需要的孔位數×50μl＋100μl；H.取出培養板，棄去孔內液體，用200μl新鮮準備的無菌PBS洗滌4遍，每洗完一次用拍板紙拍干，用加入50μl新鮮配制的酶標抗體工作液，將培養板放2?8℃冰箱孵育1h；I.取出培養板，用200μl新鮮準備的無菌PBS洗滌4遍，每洗完一次用拍板紙拍干，每孔加入底物工作液50μl，室溫避光反應7min，再以蒸餾水沖洗終止反應，放室溫干燥培養板，用放大鏡觀察結果，進行斑點計數。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴寧榆，葉愛玲，李思，李貴州，
申請(專利權)人：佛山迪安醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：