一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑制造技術

本發明專利技術公開了一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，包含人端粒酶逆轉錄酶啟動子、鐵蛋白報告基因和慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞。端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在腫瘤細胞內特異性過表達，供磁共振檢測惡性腫瘤。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，包含人端粒酶逆轉錄酶啟動子、鐵蛋白報告基因和慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞。端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在腫瘤細胞內特異性過表達，供磁共振檢測惡性腫瘤?！緦＠f明】一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑
本專利技術屬于生物
，具體涉及一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑。專利技術背景研究表明端粒酶催化亞單位即人端粒酶逆轉錄酶，簡稱為“hTERT”，在絕大多大數人腫瘤細胞和永生化細胞內表達陽性，而在正常體細胞內為陰性，與端粒酶活性具有一致性，是腫瘤細胞的特異性標志物。因此，hTERT的啟動子可以調控基因靶向性表達于端粒酶陽性的腫瘤細胞內，而且其啟動子是目前已知最廣譜的腫瘤細胞特異性啟動子。報告基因顯像技術主要是將分子生物學和顯像技術結合，實現靶分子的非侵入性顯像。鐵蛋白基因是磁共振成像(MRI)中最受關注的報告基因之一，不需引入外源性對比劑即可實現顯像。磁共振成像技術臨床應用廣泛，成像分辨率高，可同時獲得解剖和功能信息，鐵蛋白是機體主要的儲鐵蛋白，可將攝取的鐵離子聚集在蛋白殼內，形成具有超順磁性的氧化鐵顆粒，因此，應用鐵蛋白報告基因實現MR顯像的方法成為了焦點之一。本專利技術人研究發現，基因的表達受到啟動子的調控，所以通過檢測基因表達情況能間接反映啟動子的轉錄活性，但是，需通過提取細胞或組織進行免疫染色、蛋白印跡等侵入性手段來檢測啟動子驅動基因表達后帶來的效應。因此，應用非侵入性手段對端粒酶逆轉錄酶啟動子的轉錄活性進行檢測成像具有重要腫瘤學意義。應用hTERT啟動子調控鐵蛋白報告基因過表達的載體感染細胞，然后進行MR成像，使用MR鐵蛋白報告基因成像技術可以非侵入性檢測活體腫瘤細胞。
技術實現思路
本發 明的目的提供了一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，包含人端粒酶逆轉錄酶啟動子、鐵蛋白報告基因、慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞。上述本專利技術的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因插入慢病毒載體，人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子調控鐵蛋白報告基因在慢病毒載體內表達，并通過載體質粒，傳染給腫瘤細胞過表達，所述鐵蛋白報告基因為帶有flag標簽蛋白序列的鐵蛋白重鏈全基因，所述包裝質粒為p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G，所述包裝細胞為293T。在一實施方案中，本專利技術的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，包含人端粒酶逆轉錄酶啟動子、鐵蛋白報告基因、慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞，其中，人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因插入慢病毒載體，人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子調控鐵蛋白報告基因在慢病毒載體內表達，并通過載體質粒，傳染給腫瘤細胞過表達。在上述實施方案中，本專利技術的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，所述鐵蛋白報告基因為帶有flag標簽蛋白序列的鐵蛋白重鏈全基因，所述包裝質粒為pCD/NL-BH*DDD和 pLTR-G，所述包裝細胞為293T。本專利技術的另一目的提供了一種制備用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑的方法，包括以下步驟:I)根據Genbank (基因庫)代號為NM_010239的鐵蛋白重鏈(Fth)基因序列信息人工合成目的基因并接入flag標簽蛋白序列，在其兩端引入限制性內切酶NheI和BamHI 識別位點，利用DNA連接酶將所述蛋白序列克隆入慢病毒(p⑶H-CMV-MCS-Puro)載體質粒， 得到 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro 慢病毒載體；2)用Spe I和Xba I對步驟I)的慢病毒載體進行雙酶切，酶切產物電泳后回收無 CMV的載體片段；3)從含hTERT的質粒中PCR擴增hTERT啟動子片段重組入步驟2)的無巨細胞病毒(CMV)的載體片段構建成目的pCDH-hTERT-Fth-f Iag-Puro慢病毒載體；4)對步驟 3)的 pCDH-hTERT-Fth-fIag-Puro 慢病毒包裝，采用 pCD/NL_BH*DDD 和 pLTR-G包裝質粒，293T包裝細胞，構建成Lent1-hTERT-Fth-f Iag-Puro慢病毒表達載體，即得診斷劑。術語“腫瘤細胞”在本專利技術中沒有特別指明的情況下是指惡性腫瘤細胞。本專利技術的再一目的提供了一種檢測腫瘤細胞的方法，將本專利技術的用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑與腫瘤細胞接觸，將人端粒酶逆轉錄酶啟動子和鐵蛋白報告基因傳染給腫瘤細胞過表達，用MRI掃描示蹤腫瘤細胞。本專利技術的診斷劑的有益效果，現有技術直接用人端粒酶逆轉錄酶啟動子作為特異性標志物在腫瘤細胞中表達，用以檢測腫瘤細胞，但需要通過提取細胞或組織進行免疫染色、蛋白印跡等侵入性手段來檢測，且只能檢測淺表腫瘤細胞。而本專利技術的診斷劑，由于人端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在腫瘤細胞特異性過表達，而人端粒酶逆轉錄酶啟動子調控鐵蛋白報告基因在正常細胞或良性腫瘤細胞中無表達，在腫瘤細胞中過表達的鐵蛋白報告基因可以攝取外源性或內源性鐵，聚集成超磁性鐵，因此，可以用MRI成像技術示蹤檢測，因此，無需離體免疫染色測定。本專利技術的診斷劑對深部惡性腫瘤也可通過MR 鐵蛋白報告基因成像檢測，也可以對惡性和良性腫瘤進行診斷，以區分是良性還是惡性腫瘤?！緦＠綀D】【附圖說明】圖1免疫熒光染色檢測hTERT啟動子在A549和HPDLF細胞株內情況圖2免疫熒光染色檢測Fth-flag基因在A549和HPDLF細胞內表達情況圖3普羅士蘭鐵染色檢測細胞攝鐵能力 圖4磁共振對體外A549和HPDLF細胞進行T2*WI和T2*MAP掃描的信號強弱圖5磁共振對體外A549和HPDLF細胞掃描的T2信號【具體實施方式】以下實施例用于進一步理解本專利技術，但不以任何形式限制本專利技術的范圍。實施例1診斷劑的制備根據Genbank (NM_010239)鐵蛋白重鏈(Fth )基因序列信息人工合成目的基因并接入f Iag標簽蛋白序列(Fth-f Iag )，在兩端引入限制性內切酶Nhe I和 BamHI識別位點，利用DNA連接酶將合成序列克隆入慢病毒載體質粒p⑶H-CMV-MCS-Puro，命名為 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro。用 Spe I 和 Xba I 對 pCDH-CMV-Fth-f Iag-Puro 表達載體進行雙酶切，酶切產物電泳后回收無CMV的載體片段。從含hTERT啟動子的質粒中PCR擴增hTERT 啟動子片段重組入回收的載體片段構建成目的p⑶H-hTERT-Fth-flag-Puix)載體。測序無誤并檢測目的基因能表達后，進行慢病毒包裝。慢病毒包裝采用p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G 包裝質粒，293T包裝細胞，構建成慢病毒表達載體，命名為Lent1-hTERT-Fth-f lag-Puro， 即為本專利技術的診斷劑。對比實施例1無hTERT啟動子的鐵蛋白重鏈基因慢病毒表達載體的制備采用實施例1獲得的p⑶H-CMV-Fth-f Iag-Puro慢病毒載體進行慢病毒包裝， 采用p⑶/NL-BH*DDD和pLTR-G包裝質粒，293T包裝細胞，構成慢病毒表達載體，命名為 Lent1-CMV-Fth-flag-Puroo實施例2檢測測試1、材料:細胞株:人肺腺癌(A549)和人原代培養牙周膜成纖維(本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于磁共振示蹤腫瘤細胞的診斷劑，其特征在于,包含人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）啟動子、鐵蛋白報告基因、慢病毒載體、包裝質粒和包裝細胞。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張冬，楊燕，文利，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院，
類型：發明
國別省市：