HNF4α蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用制造技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，本發明專利技術采用免疫組化方法檢測HNF4α蛋白在肝癌組織中的表達量，能夠判斷肝癌患者出現遠處轉移的風險及術后狀況。本發明專利技術提供了HNF4α蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用。本發明專利技術用HNF4α蛋白作為判斷肝癌患者預后的蛋白質分子標記，對于肝細胞癌病人術后監控和序貫治療也具有重要的指導意義。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術屬于生物
，本專利技術采用免疫組化方法檢測HNF4α蛋白在肝癌組織中的表達量，能夠判斷肝癌患者出現遠處轉移的風險及術后狀況。本專利技術提供了HNF4α蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用。本專利技術用HNF4α蛋白作為判斷肝癌患者預后的蛋白質分子標記，對于肝細胞癌病人術后監控和序貫治療也具有重要的指導意義。【專利說明】HNF4a蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用
本專利技術屬于生物
，涉及一種HNF4 α蛋白的應用，具體地說，涉及HNF4 a蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用。
技術介紹
肝癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率長期居高不下。我國是世界上肝癌發病最多的國家，每年新發病例約占全球50%。統計資料表明，肝癌術后高復發轉移率(5年復發率達70%，小肝癌也達50%)已成為進一步提高遠期療效的瓶頸，肝癌預后判斷指標匱乏。肝癌轉移是一個多因素參與并相互作用的復雜過程，既關乎癌細胞本身、又與癌細胞同癌周微環境及宿主免疫狀態的相互作用有關。在肝癌中顯著升高或降低的數百種基因和/或蛋白中，至少有20余種基因和/或蛋白的表達目前被確定與肝癌的轉移相關，但這些基因和/或蛋白的敏感性及特異性尚難以滿足臨床預測要求。本領域迫切需要尋找能預測肝癌病情及預后的相關基因和/或蛋白，這方面的研究對臨床治療肝癌及預 防肝癌復發具有重要意義。HNF4 α 蛋白(hepatocyte nuclear factor4 α , HNF4 α , GeneID: 3172) ? 肝細胞核因子4 (hepatocyte nuclear factor4, HNF4 a )是一種屬于細胞核激素受體家族的轉錄因子，在分化成熟的肝細胞中高表達，其中HNF4 α是HNF4的重要亞型。HNF4 a參與維護肝細胞脂肪代謝、白蛋白合成、藥物解毒、能量代謝、膽汁酸合成等重要功能，也是維持肝細胞上皮表型的重要基因。對肝癌研究發現，肝癌去分化狀態伴隨大量肝細胞核因子表達下調，其中HNF4 α表達下調是肝癌發生的重要環節。(參見文獻:0domDTj et al.Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcriptionfactors.Science2004;303:1378-1381.Beifang Ningjet al.Hepatocyte nuclearfactors4a prevents the development of hepatocellular carcinoma.CancerResearch2010:70 (5): 7640-7651)目前為止，肝癌轉移的分子機制仍不清楚，有效的治療靶點和預后標志物也十分有限。目前還未見HNF4CI可調控肝癌轉移并用于肝癌病人預后判定的研究報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供HNF4 α蛋白的新應用，特別是在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用。本專利技術人經過廣泛而深入的研究，首次發現，采用免疫組化方法檢測HNF4ci蛋白在肝癌組織中的表達量，能夠判斷肝癌患者出現遠處轉移的風險及術后狀況。基于HNF4 α蛋白的表達量與肝細胞癌的這種相關性，以該蛋白作為分子標記對其表達量進行檢測可以用于指導肝癌病人的預后判斷。本專利技術提供了 HNF4CI蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用，該應用是指將HNF4a蛋白作為分子標記，利用HNF4a單克隆抗體或多克隆抗體，以及免疫組化實驗試劑，分析HNF4 α蛋白在肝癌組織中的表達量。所述的HNF4 α單克隆抗體為商品化抗體，(制備方法參見文獻YokoyamaWMj et al.2001.Production of Monoclonal Antibodies.Current Protocols inImmunology.74:2.5.1-2.5.25.)相應的，利用特異性抗HNF4 α蛋白的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備確定肝癌手術預后的制劑或試劑盒，這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。本專利技術還提供了使用上述試劑盒用于體外檢測HNF4 α蛋白在肝癌組織中的表達量的方法，該方法包括以下步驟:(a)利用本試劑盒中的二甲苯，乙醇，3%H202溶液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG將肝癌組織切片進行免疫組化染色；(b)利用顯微鏡和成像裝置拍攝為數碼照片；(c)利用生物圖像處理軟件分析腫瘤中陽性信號強度，給出評分。所述的該方法具體步驟如下:(I)制備肝癌組織石蠟切片，60°C烤箱過夜；(2)切片脫臘至水；(二甲苯 I ① IOmin — 二甲苯 II ② IOmin — 二甲苯 III ③ IOmin — 100% 乙醇5min — 95% 乙醇 5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —雙蒸水 5min)(3) 3%H202 溶液，室溫放置 20min ；(4)雙蒸水洗 5min X 3 ；(5)抗原修復:切片放入0.0lM檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ6.0)中煮沸30min ；(6)自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5minX3 ;(7) 1%BSA 封閉 30min, 37°C ；(8)甩去封閉液，不洗，直接加一抗(鼠HNF4ci單克隆抗體，購自R&D公司，稀釋比例1:200)。置入濕盒中4°C冰箱過夜16小時；(9)41:取出，室溫復溫151-11，然后0.0謹 PBS 洗 5minX4;(10)滴加二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG，購自丹麥DAKO公司，即用型，無需稀釋)45min，37°C ；(11)0.0lM PBS 洗 5minX4，DAB 顯色 2-10min，鏡下觀察；(12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒；(13)分化后自來水返藍，蒸餾水浸泡；(14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；(15)顯微鏡下觀察陽性染色，于肝癌組織隨機選取3個視野并拍照；(16)采用Image Scope (Aperio公司)軟件對組織樣本進行掃描，掃描后采用該軟件的Algorithms (Positive Pixel Count)程序對每個樣本進行“陽性Pixel ”計算,獲得計算數據如下表:【權利要求】1.HNF4 α蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用。2.制備肝癌預后評估試劑盒中的應用，其特征在于，使用上述試劑盒用于體外檢測HNF4a蛋白在肝癌組織中的表達量的方法，該方法包括以下步驟:根據權利要求1所述的HNF4 α蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用，其特征在于，該應用是指將HNF4 α蛋白作為分子標記，利用HNF4CI單克隆抗體或多克隆抗體，以及免疫組化實驗試劑，分析HNF4 α蛋白在肝癌組織中的表達量。3.根據權利要求2所述的HNF4ci蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用，其特征在于，其中的免疫組化實驗試劑是指二甲苯、乙醇、3%Η202溶液、1%BSA封閉液、DAB顯色試劑、蘇木素和辣根過氧化物酶。4.根據權利要求2或3所述的HNF4ci蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用，其特征在于，所述的HNF4a單克隆抗體是鼠HNF4a單克隆抗體。5.根據權利要求2或3所述的HNF4α蛋白在制備本文檔來自技高網...

【技術保護點】
HNF4α蛋白在制備肝癌預后評估試劑盒中的應用。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：寧北芳，謝渭芬，丁勁，張新，尹川，許文萍，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第二軍醫大學，
類型：發明
國別省市：