本發(fā)明專利技術(shù)涉及用于迅速并且簡(jiǎn)便的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸、單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試樣制備用的PCR引物以及用于離子交換色譜分析的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用試樣的制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)為一種單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸，其具有下述(a)～(c)的特性，(a)總鏈長(zhǎng)為200bp以下；(b)在5’末端、3’末端中的任意一個(gè)末端具有與模板DNA不完全互補(bǔ)的序列(標(biāo)識(shí)序列)；(c)與用于比較單核苷酸多態(tài)性的有無(wú)的試樣核酸的鏈長(zhǎng)差為10bp以下。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】【專利摘要】本專利技術(shù)涉及用于迅速并且簡(jiǎn)便的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸、單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試樣制備用的PCR引物以及用于離子交換色譜分析的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用試樣的制備方法。本專利技術(shù)為一種單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸，其具有下述(a)～(c)的特性，(a)總鏈長(zhǎng)為200bp以下；(b)在5’末端、3’末端中的任意一個(gè)末端具有與模板DNA不完全互補(bǔ)的序列(標(biāo)識(shí)序列)；(c)與用于比較單核苷酸多態(tài)性的有無(wú)的試樣核酸的鏈長(zhǎng)差為10bp以下。【專利說(shuō)明】單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸、單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試樣制備用的PCR引物以及用于離子交換色譜法分析的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用試樣的制備方法
本專利技術(shù)涉及用于迅速并且簡(jiǎn)便的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸。另外，本專利技術(shù)涉及單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試樣制備用的PCR引物以及用于離子交換色譜法分析的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用試樣的制備方法。
技術(shù)介紹
近年來(lái)，開(kāi)發(fā)了分析已經(jīng)明確與各種疾病或藥的副作用相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP ；Single Nucleotide Polymorphism)的技術(shù),在這些開(kāi)發(fā)中，簡(jiǎn)便并且在短時(shí)間內(nèi)精度良好地檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性成為重要的要素。作為分析單核苷酸多態(tài)性的方法，已知有RFLP法(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，Restriction Fragmet Length Polymorphism)。RFLP 法為如下方法:在存在識(shí)別 PCR(聚合酶鏈反應(yīng)，Polymerase Chain React ion)擴(kuò)增產(chǎn)物中的基因變異部的限制酶的情況下，在共有序列部位設(shè)定引物，使在其內(nèi)側(cè)即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)具有多態(tài)性，并進(jìn)行擴(kuò)增，用限制酶切斷所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)該片段的長(zhǎng)度判定多態(tài)性的有無(wú)。但是，由于使用限制酶，因此，存在分析成本提高、或分析整體的時(shí)間延長(zhǎng)等課題。另外，由于通過(guò)電泳檢測(cè)鏈長(zhǎng)差別，因此，也存在作業(yè)變煩雜、或分析整體的時(shí)間延長(zhǎng)等課題。另一方面，在生物化學(xué)領(lǐng)域或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等中，在核酸、蛋白質(zhì)、多糖類這樣的生物體高分子的分析中，作為能夠簡(jiǎn)便并且在短時(shí)間內(nèi)精度良好地檢測(cè)的方法，利用離子交換色譜法。使用離子交換色譜法時(shí)，緩和對(duì)于利用電泳的測(cè)定而言必須的煩雜的作業(yè)。非專利文獻(xiàn)I中公開(kāi)了通過(guò)高效液相色譜法分離核酸相關(guān)化合物的方法。但是，在非專利文獻(xiàn)I中公開(kāi)的方法中，存在難以充分地分離單核苷酸多態(tài)性這樣的具有接近的鏈長(zhǎng)差的核酸的問(wèn)題。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2005-027518號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2006-075126號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)高速液體夕π 7卜夕'' 9 7 4 —基礎(chǔ) 実験(用于生命科學(xué)的高效液相色譜法基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn))”、廣川書(shū)店、P.323 (1988)非專利文獻(xiàn)2 =Nature,324, p.163-166、(1986)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)要解決的問(wèn)題本專利技術(shù)的目的在于，提供用于迅速并且簡(jiǎn)便的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸。另外，本專利技術(shù)的目的在于，提供單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試樣制備用的PCR引物以及用于離子交換色譜法分析的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用試樣的制備方法。用于解決問(wèn)題的方法本專利技術(shù)為具有下述(a)?(C)的特性的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸。(a)總鏈長(zhǎng)200bp以下；(b)在5’末端、3’末端中的任意一個(gè)末端具有與模板DNA不完全互補(bǔ)的序列(標(biāo)識(shí)序列)；(c)與要比較單核苷酸多態(tài)性的有無(wú)的試樣核酸的鏈長(zhǎng)差為IObp以下。以下，詳細(xì)說(shuō)明本專利技術(shù)。本專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用具有特定的特性的試樣核酸，能夠迅速并且簡(jiǎn)便地檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，從而完成了本專利技術(shù)。AS-PCR(等位基因特異性PCR，Allele Specific-PCR)法是檢測(cè)利用序列特異性的擴(kuò)增反應(yīng)的基因多態(tài)性(特別是單核苷酸多態(tài)性)的方法。具體而言，使想要檢測(cè)的單核苷酸多態(tài)性的堿基序列成為引物的3’末端，進(jìn)行PCR。在目標(biāo)核酸的序列與引物完全互補(bǔ)的情況下，通過(guò)DNA聚合酶引起延長(zhǎng)反應(yīng) 。另一方面，在目標(biāo)核酸的序列與引物不完全互補(bǔ)的情況下，阻礙DNA聚合酶的延長(zhǎng)反應(yīng)。這樣，是使用在3’末端具有單核苷酸多態(tài)性的野生型或變異型的堿基序列的2種引物，基于擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的判定的方法。作為AS-PCR法，可以使用非專利文獻(xiàn)2中公開(kāi)的方法。本專利技術(shù)中的AS-PCR，所使用的引物具有以下的特征。(I)正向引物使用變異型用、野生型用的2種，變異型用在3’末端具有單核苷酸多態(tài)性的堿基序列，野生型用在3’末端(相當(dāng)于單核苷酸多態(tài)性部位)具有野生型的堿基序列。(2)上述2種正向引物中的一種引物在5’末端具有與目標(biāo)核酸的堿基序列不完全互補(bǔ)的序列(以下有時(shí)稱為“標(biāo)識(shí)序列”)。(3)上述標(biāo)識(shí)序列的鏈長(zhǎng)為IObp以下。(4)上述2種正向引物以擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)達(dá)到200bp以下的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。(5)反向引物使用在變異型用、野生型用中共同的引物。(6)上述反向引物，在通過(guò)變異型用正向引物復(fù)制在5’末端具有標(biāo)識(shí)序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的情況下，能夠在PCR擴(kuò)增的第2次循環(huán)以后復(fù)制在3’末端具有標(biāo)識(shí)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。在上述的引物中，示意地說(shuō)明變異型用引物具有標(biāo)識(shí)序列的情況下的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特征。(A)PCR擴(kuò)增的第I次循環(huán)的特征如下。變異型用、野生型用的2種引物對(duì)于變異型的模板DNA、野生型的模板DNA而言分別退火后，分別進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)，分別復(fù)制變異型DNA、野生型DNA。此時(shí)，被復(fù)制的變異型DNA相對(duì)于被復(fù)制的野生型DNA，僅標(biāo)識(shí)序列的鏈長(zhǎng)部分總鏈長(zhǎng)長(zhǎng)。(B)PCR擴(kuò)增的第2次循環(huán)以后的特征如下。反向引物在變異型DNA的復(fù)制產(chǎn)物(在5’末端具有標(biāo)識(shí)序列)以及野生型DNA的復(fù)制產(chǎn)物分別退火后，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)，分別復(fù)制變異型DNA、野生型DNA。此時(shí)，通過(guò)反向引物復(fù)制的變異型DNA，也相對(duì)于被復(fù)制的野生型DNA，僅標(biāo)識(shí)序列的鏈長(zhǎng)部分總鏈長(zhǎng)長(zhǎng)。這樣得到的僅標(biāo)識(shí)序列部分總鏈長(zhǎng)不同的2種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)后述的離子交換色譜法進(jìn)行分離分析。上述示意的說(shuō)明中，以2種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠通過(guò)離子交換色譜法進(jìn)行分離分析作為限度，可以在變異型用引物、野生型用引物二者上附加標(biāo)識(shí)序列，除了通常使用的引物應(yīng)該具備的特性之外，不限于標(biāo)識(shí)序列，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言能夠容易地理解。需要說(shuō)明的是，正向引物、反向引物的用詞以本專利技術(shù)的
中的通常的含義進(jìn)行使用，正向引物使用在變異型用、野生型用中共同的引物，反向引物中變異型用的在5’末端附加標(biāo)識(shí)序列這樣的形態(tài)當(dāng)然也包括在本專利技術(shù)的范圍內(nèi)。以往，在引物上付加與本專利技術(shù)同樣的標(biāo)識(shí)序列的情況下，以非特異反應(yīng)的避免(專利文獻(xiàn)I)、利用標(biāo)識(shí)探針的檢測(cè)(專利文獻(xiàn)2)為目的，沒(méi)有作為離子交換色譜法用的試樣、特別是單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)用試樣的例子。如上所述，本專利技術(shù)中，提供單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸、單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試樣制備用的PCR引物以及用于離子交換色譜法分析的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用試樣的制備方法。本專利技術(shù)的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法中，使用離子交換色譜。用于離子交換色譜法的洗脫液，優(yōu)選含有由下述式(I)所示的胍衍生的胍鹽。【權(quán)利要求】1.一種單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)用的試樣核酸，其具有下述(a)?(本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：與谷卓也，清遠(yuǎn)英司，牛澤幸司，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：積水醫(yī)療株式會(huì)社，
類型：
國(guó)別省市：
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