嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法技術

本發明專利技術涉及嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法，具體地公開了一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr。本發明專利技術還公開了該酶的制備方法，本發明專利技術的制備嘌呤核苷磷酸化酶具有產量高且熱穩定性好的特點。本發明專利技術還公開了編碼該嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體和宿主細胞。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術涉及，具體地公開了一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr。本專利技術還公開了該酶的制備方法，本專利技術的制備嘌呤核苷磷酸化酶具有產量高且熱穩定性好的特點。本專利技術還公開了編碼該嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體和宿主細胞?！緦＠f明】
本專利技術涉及基因工程領域，具體地涉及一種。
技術介紹
嘌呤核苷憐酸化酶(purine nucleoside phosphorylase),簡稱PNP,是嘌呤補救合成途徑的關鍵酶之一，廣泛存在于哺乳動物、寄生蟲和微生物中。按照嘌呤核苷磷酸化酶的蛋白結構可分為兩類:低分子量的同源三聚體類和高分子量的同源六聚體類。其中哺乳動物和部分微生物(例如鼠傷寒沙門氏菌salmonella typhimurium,嗜熱古菌芝田硫化葉菌Sulfolobus solfataricus等)的嘌呤核苷磷酸化酶屬于同源三聚體類,其分子量約為80~IOOkDa,每個亞基的分子量為30~32kDa，通常此類嘌呤核苷磷酸化酶只能以鳥嘌呤核苷和肌苷作為底物。而同源六聚體類的嘌呤核苷磷酸化酶，底物專一性不強，既可接受鳥嘌呤核苷和肌苷作為底物，也可以腺嘌呤核苷作為底物。其分子量約為150kDa，亞基分子量為25kDa左右。由于PNP特殊的生物活性，使得其在醫藥領域得到了較大的應用:①應用于核苷類藥物的合成，大量研究表明，核苷類(核苷及其類似物)具有廣泛的抗腫瘤抗病毒的效果。②應用于腫瘤靶向治療；③應用于無機磷和ATPase酶活力等的定量測定。鑒于PNP的廣泛應用前景，近年來，關于PNP的基因工程研究越來越多，但多以大腸桿菌PNP和嗜熱菌PNP為主。而本專利技術選取克隆假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的PNP，簡稱為PiPNP，其相對于其他菌屬的PNP有著一個顯著的優點，即該酶在低溫(小于400C )下的即有較高的催化效率，研究發現，在體外，催化低濃度或高濃度的肌苷反應時，PiPNP的最適溫度為30— 35°C或50— 60°C，明顯低于其他菌屬的PNP (例如大腸桿菌PNP催化低濃度或高濃度的肌苷反應最適溫度分別為50°C或60-70°C)，這就使得在常規反應溫度下(37°C )，PiPNP使用較少的量就可獲得較高的催化效率。但PiPNP相較于其他菌屬的PNP也存在其缺陷——溫度穩定性較低，將PiPNP保溫30min，在37-42°C時酶活發生急劇變化，50°C完全失活，EcPNP在50-55°C發生急劇變化，65°C時完全喪失失活。另外，據已報道的各方面研究，重組菌發酵生產的PNP產量仍較低，多為100~200U/ml，對于工業化生產而言，仍不能達到很好的效果，產量有待提高。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種經過分子改造并具有較高熱穩定性的嘌呤核苷磷酸化酶，以及高產量的制備該嘌呤核苷磷酸化酶的方法。本專利技術第一方面提供了一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr0在另一優選例中，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一種或多種特性:(a)比酶活≥30U/mg,較佳地為≥45U/mg ；(b)儲存在堿性環境中；(C)失活溫度<60°C ;(d)在O — 55°C，保存時間汕。在另一優選例中，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的最適PH值為7.0-9.0，較佳地為7.5-8.5，更佳地為8.0。在另一優選例中，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。本專利技術第二方面提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼第一方面所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶。在另一優選例中，所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一個或多個密碼子被替換為大腸桿菌相對應的偏愛密碼子。在另一優選例中，所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密碼子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一個或多個密碼子被替換為CGA、CTG、CTG、ATC、CTG 和 CTG。在另一優選例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本專利技術第三方面提供了一種載體，所述載體含有第二方面所述的多核苷酸。在另一優選例中，所述載體為表達載體,更佳地為適合在大腸桿菌中表達的表達載體。本專利技術第四方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含第三方面所述的載體或基因組中整合有第二方面所述的多核苷酸。在另一優選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。在另一優選例中，所述宿主細胞為大腸桿菌(E.coli)細胞。本專利技術第五方面提供一種第一方面所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，包括以下步驟:(a)在適合表達的條件下，培養第四方面所述的宿主細胞，從而表達出第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶；(b)分離所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。在另一優選例中，所述的宿主細胞為大腸桿菌。在另一優選例中，在步驟(a)之前，所述方法還包括以下步驟:(I)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；(2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，并且任選地，將所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45中的一個或多個密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為大腸桿菌相對應的偏愛密碼子，從而制得編碼第一方面所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；(3)將上一步驟制得的所述多核苷酸序列導入宿主細胞，從而制得第四方面所述的宿主細胞。在另一優選例中，步驟(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。在另一優選例中，所述野生型或野生型的酶是來自假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷憐酸化酶。在另一優選例中，將第97位Asp的密碼子GAC突變為編碼Tyr的密碼子TAT。在另一優選例中，將所述密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為CGA、CTG、CTG, ATC, CTG 和 CTG。在另一優選例中，所述方法獲得的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的表達活性> 300U/ml，較佳地為 350 - 450U/ml。本專利技術第六方面提供了一種改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，所述方法包括步驟:(I)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；(2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，從而制得編碼突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；(3)表達上一步驟制得的所述多核苷酸序列，從而制得突變的嘌呤核苷磷酸化酶。在另一優選例中，所述方法用于提高嘌呤核苷磷酸化酶的穩定性。在另一優選例中，步驟(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本專利技術第七方面提供了一種第一方面所本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李子樵，沈露，
申請(專利權)人：上海藍怡科技有限公司，
類型：發明
國別省市：