DNA結(jié)合蛋白的檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟：提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo?III存在的條件下進行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液；將消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進行等溫擴增反應(yīng)后得到擴增液；將納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進行孵育后得到納米金檢測探針溶液；將擴增液和納米金檢測探針溶液混合后對混合液進行檢測，完成DNA結(jié)合蛋白的檢測。這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，通過第一檢測探針和第二檢測探針與擴增產(chǎn)物中靶DNA的結(jié)合，使得結(jié)合了檢測探針的納米金顆粒發(fā)生聚集，導(dǎo)致混合液的顏色發(fā)生變化，現(xiàn)象直觀，靈敏度較高。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術(shù)公開了一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟：提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo?III存在的條件下進行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液；將消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進行等溫擴增反應(yīng)后得到擴增液；將納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進行孵育后得到納米金檢測探針溶液；將擴增液和納米金檢測探針溶液混合后對混合液進行檢測，完成DNA結(jié)合蛋白的檢測。這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，通過第一檢測探針和第二檢測探針與擴增產(chǎn)物中靶DNA的結(jié)合，使得結(jié)合了檢測探針的納米金顆粒發(fā)生聚集，導(dǎo)致混合液的顏色發(fā)生變化，現(xiàn)象直觀，靈敏度較高。【專利說明】DNA結(jié)合蛋白的檢測方法
本專利技術(shù)涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法。
技術(shù)介紹
簡單靈敏的檢測人體細胞中轉(zhuǎn)錄因子對于臨床診斷以及藥物的篩選有著重要的意義。目前的檢測方法都是基于電泳遷移，免疫化學(xué)或者是熒光檢測的方法，這些方法都是通過非擴增而直接進行檢測，因此靈敏度較低。而且這些方法存在著放射性污染或者需要特異性抗體和熒光標(biāo)記的探針，大大增加了實驗成本和實驗的復(fù)雜性。DNA結(jié)合蛋白在基因組復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄，細胞分裂和DNA修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用。而大部分的DNA結(jié)合蛋白都扮演著轉(zhuǎn)錄因子的角色，調(diào)節(jié)著細胞的發(fā)育，分化和增殖，由此轉(zhuǎn)錄因子也已經(jīng)成為臨床診斷和藥物篩選中的靶點。目前為止絕大部分都是采用非擴增的直接檢測的方法來定量轉(zhuǎn)錄因子，其中包括電泳遷移法(EMSA)，DNA酶足跡法；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，免疫印跡法(western blotting)和基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的方法。其中電泳遷移法(EMSA)和DNA酶足跡法屬于傳統(tǒng)檢測方法，都是利用同位素標(biāo)記DNA探針和凝膠電泳分離來檢測DNA-蛋白復(fù)合物。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫印跡法(western blotting)是通過抗原和抗體的特異性反應(yīng),然后經(jīng)酶標(biāo)抗體的底物顯色反應(yīng)來檢測DNA結(jié)合蛋白。基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的方法則是利用DNA與蛋白的相互作用，使標(biāo)記有熒光的兩段DNA探針相互靠近而發(fā)生FRET;或者是標(biāo)記有熒光的DNA探針與蛋白的相互作用后對DNA序列起到保護作用，外切酶Exo III不能進行切割DNA探針從而發(fā)生FRET，以此來檢測DNA結(jié)合蛋白。然而，傳統(tǒng)的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法靈敏度都偏低。
技術(shù)實現(xiàn)思路
基于此，有必要提供一種靈敏度較高的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法。一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟:提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo III存在的條件下進行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液，其中，未被Exo III切割的DNA的反義鏈作為引物被保留在所述消化液中；將所述消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進行等溫擴增反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到擴增液，其中，所述擴增模板包括η段重復(fù)序列以及η-1段依次連接所述重復(fù)序列的連接序列，所述引物與所述重復(fù)序列特異性結(jié)合，所述連接序列包括所述內(nèi)切酶的酶切位點，η為不小于2的整數(shù)，所述引物擴增后得到所述擴增模版的互補序列，所述擴增模版的互補序列被所述內(nèi)切酶切割形成η段包含所述重復(fù)序列的靶DNA ；提供納米金顆粒溶液，并將所述納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進行孵育，孵育完成后得到納米金檢測探針溶液，其中，所述第一檢測探針與所述靶DNA特異性互補，所述第二檢測探針與所述靶DNA特異性互補；將所述擴增液和所述納米金檢測探針溶液混合，反應(yīng)完全后對混合液進行檢測，完成所述DNA結(jié)合蛋白的檢測。在一個實施例中，所述提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液的操作為:將HeLa細胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，置于加濕處理的含有5% 二氧化碳的37°C培養(yǎng)箱中，加入20納克每毫升TNF- α進行刺激，30分鐘后用細胞核提取物試劑盒裂解細胞，收集細胞提取物即為所述待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液。在一個實施例中，所述DNA結(jié)合蛋白為NF- K B ρ50蛋白。在一個實施例中，所述聚合酶為KF聚合酶，所述內(nèi)切酶為Nb.BbvCI內(nèi)切酶。在一個實施例中，η=2。在一個實施例中，所述納米金顆粒溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸法制備得到。在一個實施例中，對所述混合液進行檢測的操作可以為:肉眼直接觀察，混合液中的納米金檢測探針發(fā)生聚集，顏色由紅色變?yōu)樽仙Ｔ谝粋€實施例中，對所述混合液進行檢測的操作可以為:采用分光光度計檢測混合液，光譜采集范圍為410nm?800nm,檢測最大吸收峰。在一個實施例中，所述作為引物的DNA的反義鏈的序列為SEQ ID N0.1所示的序列。在一個實施例中，所述擴增模板的序列為SEQ ID N0.2所示的序列；所述第一檢測探針的序列為SEQ ID N0.3所示的序列；所述第二檢測探針的序列為SEQ ID N0.4所示的序列。這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，通過特異性互補的檢測探針與擴增產(chǎn)物中的靶DNA結(jié)合，使得結(jié)合了第一檢測探針和第二檢測探針的納米金顆粒發(fā)生聚集，導(dǎo)致混合液的顏色發(fā)生變化。與傳統(tǒng)的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法相比，這種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法由于結(jié)合了擴增方法與納米金比色法，靈敏度較高，實驗現(xiàn)象簡單直觀。【專利附圖】【附圖說明】圖1為一實施方式的DNA結(jié)合蛋白的檢測方法的流程圖。圖2為DNA結(jié)合蛋白的檢測方法的機理圖。圖3為納米金顆粒(AuNP)的透射電鏡圖。圖4為為非變性凝膠電泳分析等溫指數(shù)擴增反應(yīng)產(chǎn)物；泳道I表示存在8納摩爾每升的NF- K B p50特異性探針和8納摩爾每升的NF- κ B ρ50 ;泳道2表示存在8納摩爾每升的NF- κ B ρ50特異性探針，不存在8納摩爾每升的NF- κ B ρ50 ;泳道3表示合成的長度為24個堿基的寡核苷酸；泳道4表示DNA marker (分子質(zhì)量參照)。圖5為NF-κ B p50蛋白與非特異性探針的結(jié)合后納米金吸收光譜的變化；曲線a表示存在2納摩爾NF- κΒ p50蛋白和2納摩爾特異性探針；曲線b表示存在2納摩爾NF-kB p50蛋白和2納摩爾非特異性探針；曲線c表示存在2納摩爾特異性探針，不存在蛋白。圖6為A700/A525的吸收峰比值隨NF-κ B ρ50蛋白濃度變化的曲線。圖7為圖6所示的曲線取對數(shù)后得到的Α700/Α525的吸收峰比值與NF-κ B ρ50蛋白濃度的指數(shù)線性圖，線性關(guān)系從5皮摩爾到2000皮摩爾。圖8為凝膠遷移實驗(EMSA)驗證HeLa細胞核提取物中NF- κ B p50蛋白的活性；泳道1，存在10微克未經(jīng)TNF- α誘導(dǎo)的細胞核提取物和4皮摩爾的NF- κ B探針；泳道2，存在10微克經(jīng)TNF- α誘導(dǎo)的細胞核提取物，不存在NF- κ B探針；泳道3，存在10微克經(jīng)TNF- α誘導(dǎo)的細胞核提取物和4皮摩爾的NF- κ B探針。圖9為存在2納摩爾每升的NF-κ B探針和細胞核提取物時，納米金的吸收光譜圖；(a)TNF_a誘導(dǎo)過的細胞核提取物(25納克每微升)；(b)TNF_a未誘導(dǎo)過的細胞核提取物(25納克每微升)；(C)不存在細胞核提取物。【具體實本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種DNA結(jié)合蛋白的檢測方法，包括如下步驟：提供待檢測的DNA結(jié)合蛋白的樣品溶液，在Exo?III存在的條件下進行消化反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到消化液，其中，未被Exo?III切割的DNA的反義鏈作為引物被保留在所述消化液中；將所述消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內(nèi)切酶和擴增模板存在的情況下，進行等溫擴增反應(yīng)，反應(yīng)完全后得到擴增液，其中，所述擴增模板包括n段重復(fù)序列以及n?1段依次連接所述重復(fù)序列的連接序列，所述引物與所述重復(fù)序列特異性結(jié)合，所述連接序列包括所述內(nèi)切酶的酶切位點，n為不小于2的整數(shù)，所述引物擴增后得到所述擴增模版的互補序列，所述擴增模版的互補序列被所述內(nèi)切酶切割形成n段包含所述重復(fù)序列的靶DNA；提供納米金顆粒溶液，并將所述納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進行孵育，孵育完成后得到納米金檢測探針溶液，其中，所述第一檢測探針與所述靶DNA特異性互補，所述第二檢測探針與所述靶DNA特異性互補；將所述擴增液和所述納米金檢測探針溶液混合，反應(yīng)完全后對混合液進行檢測，完成所述DNA結(jié)合蛋白的檢測。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張春陽，張艷，
申請(專利權(quán))人：深圳先進技術(shù)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：