本發(fā)明專利技術(shù)公開了利用銀耳(Stereum?hirsutum)菌體作為催化劑轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯混合物合成銀杏內(nèi)酯B的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)通過對銀耳菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，從試管斜面、液體搖瓶、種子培養(yǎng)和菌體分離，利用菌體作為催化劑，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯合成銀杏內(nèi)酯B，轉(zhuǎn)化液經(jīng)過離心、乙酸乙酯萃取、無水酒精結(jié)晶把銀杏內(nèi)酯B從發(fā)酵液分離出來。利用該方法所得到的銀杏內(nèi)酯B的純度≥99％，銀杏內(nèi)酯轉(zhuǎn)化率>90％。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術(shù)公開了利用銀耳(Stereum?hirsutum)菌體作為催化劑轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯混合物合成銀杏內(nèi)酯B的方法，屬于生物
。本專利技術(shù)通過對銀耳菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，從試管斜面、液體搖瓶、種子培養(yǎng)和菌體分離，利用菌體作為催化劑，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯合成銀杏內(nèi)酯B，轉(zhuǎn)化液經(jīng)過離心、乙酸乙酯萃取、無水酒精結(jié)晶把銀杏內(nèi)酯B從發(fā)酵液分離出來。利用該方法所得到的銀杏內(nèi)酯B的純度≥99％，銀杏內(nèi)酯轉(zhuǎn)化率>90％。【專利說明】利用銀耳菌體作為催化劑制備銀杏內(nèi)酯B的方法
本專利技術(shù)涉及生物工程
，通過銀耳菌體菌種液體培養(yǎng)，同時(shí)轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物制備銀杏內(nèi)酯B的一種新工藝。
技術(shù)介紹
研究證明銀杏內(nèi)酯是銀杏葉中主要的活性成分之一，是一類特異有效的血小板活化因子(Platelet activating factor PAF)受體拮抗劑。血小板活化因子是由血小板和多種炎癥組織分泌產(chǎn)生的一種內(nèi)源性磷酯，是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血小板聚集誘導(dǎo)劑，與許多疾病的產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)。銀杏內(nèi)酯作為PAF受體特異性拮抗劑，具有廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B對中樞神經(jīng)系統(tǒng)與缺血損傷有保護(hù)作用，抗休克、抗過敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可降低肝門靜脈壓提高全身血管耐受性，說明它對肝硬化有一定的療效。銀杏內(nèi)酯對于腎損傷有治療作用。這些作用都與銀杏內(nèi)酯B作為PAF受體拮抗劑有關(guān)，并且它目前被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的、最有臨床應(yīng)用前景的天然血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑。目前國內(nèi)外生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B的方法主要是從銀杏葉提取物，已見報(bào)導(dǎo)的銀杏內(nèi)酯B的專利共有51篇，其中一部分是關(guān)于銀杏內(nèi)酯B的制劑的制備(如:一種銀杏內(nèi)酯B固體分散體及其制備方法，申請?zhí)?CN200910204198.4)，三篇關(guān)于銀杏內(nèi)酯B及其衍生物的生理學(xué)功能(銀杏內(nèi)酯B的一種新用途；申請?zhí)?CN200910092750.5 ;銀杏內(nèi)酯B衍生物在制藥中的新用途，申請?zhí)?CN200910234319.X ;銀杏內(nèi)酯B水解衍生物及其用途，申請?zhí)?CN201010122039.2)。而關(guān)于銀杏內(nèi)酯B的制備只有九篇(一種從銀杏葉或銀杏葉提取物中提取銀杏內(nèi)酯B的新方 法，申請?zhí)?00510063407.X ;—種從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B的方法，申請?zhí)?CN201010608847.X，等等)，銀杏內(nèi)酯中含有銀杏內(nèi)酯A、B、C、M等同系物，這些專利是采用分離技術(shù)從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B，難以在工業(yè)上大批量生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B。本專利技術(shù)所使用的銀耳菌種，可選任意一種銀耳子實(shí)體，例如云南、西藏或山西的銀耳，通過組織分離即可得到。該菌不形成或很難形成子實(shí)體，分枝，有鎖狀聯(lián)合，近無色。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供的是一種銀杏內(nèi)酯B的生產(chǎn)技術(shù)，該技術(shù)不是單純的利用分離提純方法獲得大量的銀杏內(nèi)酯B,而是以銀耳(Tremella fuciformis)為菌種通過液體培養(yǎng)技術(shù)得到菌體，菌體作為催化劑，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯混合物中銀杏內(nèi)酯A、C和M生成銀杏內(nèi)酯B，以及通過提取步驟獲得銀杏內(nèi)酯B制品。本專利技術(shù)以銀耳為出發(fā)菌株，進(jìn)行試管菌種傳代、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、催化轉(zhuǎn)化等步驟制得含有銀杏內(nèi)酯B的反應(yīng)液，含有銀杏內(nèi)酯B的反應(yīng)液經(jīng)過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復(fù)溶，-20°C結(jié)晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內(nèi)酯B晶體。其中所述的試管菌種的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，1994:P367);其中所述的試管斜面菌種培養(yǎng)工藝為斜面菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，20~32°C培養(yǎng)5~20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫黄渲兴龅囊后w搖瓶培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5~40,玉米粉5~25,蛋白胨I~20, KH2PO4I~6, MgSO4I~4,加水至適當(dāng)體積,起始PH值為5.0~8.0，100~140°C滅菌20~60分鐘；其中所述的搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:250mL三角瓶裝液量為60~150mL，接種3~4塊4X4mm小塊菌種，置于溫度22~30°C，轉(zhuǎn)速120~160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24~48小時(shí)；其中所述的種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5~40，玉米粉5~25，蛋白胨I~10，KH2PO4I~6，MgSO4I~4，消泡劑0.1~0.8，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0~8.0，100~140°C滅菌20~60分鐘；其中所述種子罐的培養(yǎng)條件是:接種量5~10% (種子液體積/接種后體積)，培養(yǎng)溫度22~30°C，攪拌速率90~150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.3~Iv / v / m，培養(yǎng)時(shí)間80~90小時(shí)；其中所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液為(單位為克/升):銀杏內(nèi)酯10~50，起始pH值為5.0~8.0 ;其中所述轉(zhuǎn)化工藝條件是:種子液4000~6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5~20分鐘，收集菌體，菌體與反應(yīng)液按1:5~50 (重量:體積)混勻，在溫度溫度22~30°C，攪拌速率90~150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.3~Iv / V / m，反應(yīng)6~18小時(shí)；其中所述的銀杏內(nèi)酯B提取工藝為，轉(zhuǎn)化液4000~6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10~20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)PH1.0~4.0，連續(xù)用0.3~3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取2~4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結(jié)晶24~120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。本專利技術(shù)所使用的銀耳菌種，可選任意一種銀耳子實(shí)體，例如云南、西藏或山西的銀耳，通過組織分離即可得到。該菌不形成或很難形成子實(shí)體，分枝，有鎖狀聯(lián)合，近無色。本專利技術(shù)所述的工藝銀杏內(nèi)酯B白色，純度> 99%，銀杏內(nèi)酯轉(zhuǎn)化率>90%。根據(jù)此工藝采用的銀杏內(nèi)酯測定方法為:精密稱取銀杏內(nèi)酯B對照品10mg，溶于ImL色譜級甲醇中，配制成IOmg / mL的標(biāo)準(zhǔn)液。0.2 μ m微孔濾膜過濾，控制進(jìn)樣量為1、2、3、4、5、6、7和8μ 1，利用高效液相色譜儀(HIMADZU (島津)LC-20AT)測定銀杏內(nèi)酯B含量。色譜柱為硅膠柱(4.6.ιΧ250πιπι，10μπι)。測定條件為流動相:甲醇:0.I %磷酸溶液=10:90 ;柱溫:30°C，流速:0.8mL / min，檢測波長:270nm。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)⑴，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，求得銀杏內(nèi)酯濃度與峰面積的線性回歸方程。吸取樣品液(發(fā)酵過程中和發(fā)酵后)的上清液少量，用0.45 μ m微孔濾膜過濾，按上述色譜條件分別測定峰面積，采用外標(biāo)峰面積根據(jù)上述求得的銀杏內(nèi)酯B濃度與峰面積的回歸方程計(jì)算銀杏內(nèi)酯B含量。銀杏內(nèi)酯B轉(zhuǎn)化率按下列公式⑴計(jì)算: 式中，Rt為t時(shí)間銀杏內(nèi)酯B的轉(zhuǎn)化率；CQ(mg/L)，V0(mL)為O小時(shí)加入的銀杏內(nèi)酯濃度和培養(yǎng)基體積；Ct(mg/L)和Vt(mL)為反應(yīng)t小時(shí)銀杏內(nèi)酯B的濃度和反應(yīng)液體積。【具體實(shí)施方式】為了進(jìn)一步闡述本專利技術(shù)的技術(shù)方案所涉及的材料及工藝，給出了以下實(shí)施例。這些實(shí)施例不以任何方式限制本專利技術(shù)的范圍。實(shí)施例1試管菌種的制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
利用銀耳菌體作為催化劑制備銀杏內(nèi)酯B的方法，其特征在于以銀耳為出發(fā)菌株，通過試管斜面菌種、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、離心獲得菌體，菌體催化銀杏內(nèi)酯合成含有銀杏內(nèi)酯B的反應(yīng)液，含有銀杏內(nèi)酯B的反應(yīng)液經(jīng)過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復(fù)溶，?20℃結(jié)晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內(nèi)酯B晶體。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張志才，
申請(專利權(quán))人：張志才，
類型：發(fā)明
國別省市：
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