通過離子型表面活性劑選擇性裂解細胞制造技術

本發明專利技術披露了用于選擇性裂解在包含微生物（如細菌或單細胞真菌）的樣品中的真核細胞的方法、成套試劑盒以及裝置。該選擇性裂解是通過在堿性條件下在離子型表面活性劑中孵育該樣品而獲得的。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】通過離子型表面活性劑選擇性裂解細胞專利
本專利技術涉及真核細胞的裂解，具體地說涉及動物細胞(如血細胞)的裂解。本專利技術進一步涉及在含有大量其他細胞的樣品中的少量微生物(如細菌或真菌)的檢測。專利技術背景分子診斷學旨在快速檢測在樣品(如血液)中微量的病原體(典型地是細菌)。然而，血液是一種復雜的基質，并且包含用于適應性免疫系統的白細胞(白血球)、用于氧輸送的紅細胞(紅血球)、以及用于傷口愈合的血小板(凝血細胞)。這種組成使得在含有大量細胞物質的樣品(如全血)中直接檢測病原體變得復雜。經典的檢測方法包括在選擇性介質和/或含有指示劑的介質上使細菌生長。在可以進行細菌鑒定之前，這樣的分析典型地需要至少I天或2天的培養步驟。對基于PCR的方法而言，在新鮮血樣中的細菌量在理論上高到足以在沒有進一步培養存在于這樣的樣品之內的細菌的情況下被檢測到。然而，為了允許及早檢測到微量的細菌，需要較大體積的血液。特別是在白細胞中的大量DNA顯著增加了基于DNA的檢測方法中的背景。來自血紅蛋白中的血紅素的存在也強烈降低了 DNA聚合酶的活性。一微升人全血含有大約4，000到11，000個白細胞和大約150,000到400，000個血小板。DNA在血液中的濃度在30 μ g/ml與60 μ g/ml之間。在體積為IOml的全血中檢測大約10到100，000個的細菌種類的存在是極其挑戰性的。大量的白細胞DNA可能產生不相關的PCR產物，或者可能清除為檢測細菌DNA所設計的引物。這使得在可以通過PCR或其他方法檢測細菌DNA之前的真核DNA的徹底DNA純化和分離成為必需。除干擾PCR反應本身之外，哺乳動物DNA的量增加了樣品的粘度。另夕卜，來自于裂解的哺乳動物細胞的蛋白質和膜形成妨礙樣品過濾的復合物。這對小型化裝置而言尤其是個問題。進一步稀釋較大樣品體積導致不可接受的較長操作步驟。針對以上原因，相應地需要從血樣中去除人類DNA的方法。在哺乳動物DNA存在下明確分析細菌DNA的方法是已知的。來自于SIRS實驗室公司(company SIRSLab)的Looxters?使用一種方法來富集來自樣品的甲基化DNA。由于細菌DNA被強烈甲基化，這種方法導致細菌DNA的富集。來自Molzym公司的Molysis?使用離液劑和洗滌劑來選擇性裂解哺乳動物細胞。在這個裂解步驟之后用不受這種離液劑/洗漆劑影響的DNA酶消化。替代途徑(如由羅氏(Roche)商業化的Septifast?)依賴于特別設計為防止與人類DNA的非特異性結合和人類DNA的擴增的PCR引物對。US 6，803，208描述了一種方法，其中在37°C下使摻雜有細菌的血小板的高度稀釋懸浮液裂解15分鐘，隨后可能在0.4 μ m過濾器上過濾少量的裂解樣品，以用于目視檢查保留在過濾器上的細菌。然而這種方法不允許在環境溫度下處理較大體積的樣品。皇家菲利浦電子有限公司(Koninkli jke Philips Electronics N.V.)的未出版國際專利申請PCT/IB2010/055628披露了一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品中的真核細胞的方法，其中向包含真核細胞的樣品中添加非離子型洗滌劑(如Triton X-1OO (聚乙二醇p-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基醚)和緩沖劑以獲得具有至少9.5的PH值的溶液，并且孵育所述溶液持續充分長到足以裂解真核細胞的時間段。通過裂解在樣品中的白細胞和紅細胞，在保持病原性微生物完整的同時使血細胞DNA降解，這種方法允許處理具有5ml的體積的血樣，并且可以隨后通過離心或過濾進行富集。在H.Heerklotz的論文“表面活性劑與脂質膜的相互作用(Interactions ofsurfactants with lipid membranes)，，(生物物理學季評(Quarterly Reviews ofBiophysics)41 (2008)，第205-264頁)中，其論述了選擇性裂解哺乳動物細胞的假設分子機制，并且假設所述選擇性裂解依賴于不同的步驟。首先，表面活性劑確保白細胞和紅細胞的裂解。為了實現這個目的，表面活性劑需要被插入細胞膜的外層中。在第二個步驟中，表面活性劑將進行所謂的翻轉(flip-flop)，并且被轉移到細胞膜的內層中。一旦在內細胞膜和外細胞膜中存在足量的表面活性劑，細胞將被裂解。發現非離子型表面活性劑(如TritonX-100)良好地適合用于細胞裂解，因為它們在數百毫秒的時間范圍內進行上述步驟。相比之下，SDS需要10到30秒才能插入PC囊泡中。另外，如SDS在室溫下所顯示的，據報道具有更大的或帶電的頭基的表面活性劑穿過膜可能需要數小時或數天。如已經在科學文獻中所描述的(參見Heerklotz, H.)，這個假設可以解釋為何離子型表面活性劑不適合于獲得哺乳動物細胞的快速裂解。包含大的、龐大的或帶電的親水基團的表面活性劑(如Tween?)、具有長PEG鏈的離子型表面活性劑和Triton的翻轉運動(flip-flop movement)緩慢，并且因此不適合于獲得快速細胞裂解。另外，具有極疏水性質的表面活性劑(如B1 35或Triton X_45)在其初始插入細胞膜中將遇到困難。離子型表面活性劑被視為不適合用于獲得哺乳動物細胞的快速裂解，這是因為，由于必須穿過親脂性膜的帶電親水基團的存在，這些離子型表面活性劑的帶電親水基團不能容易地進行翻轉轉移。與科學知識相反，意外地發現當離子型表面活性劑與高pH值組合使用時，所述離子型表面活性劑可以在保持微生物病原體完整的同時用于選擇性裂解白細胞和紅細胞。因此，在第一方面，本專利技術提供了一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞的方法。在第二方面，本專利技術提供了一種用于進行選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞的方法的成套部件。在一個另外的方面，本專利技術提供了 一種用于檢測在含有真核細胞的樣品中的微生物的裝置。專利技術概述本專利技術的特定和優選方面陳述于附隨的獨立和從屬權利要求中。在適當情況下，來自從屬權利要求的特征可以與獨立權利要求的特征和其他從屬權利要求的特征組合，而不是僅僅如在權利要求所明確陳述的。本專利技術的一個方面涉及一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞(尤其是動物細胞)的方法。這種方法包括以下步驟:提供含有或者疑似含有微生物的具有真核細胞(尤其是動物細胞)的樣品；向樣品添加具有大約9.0或更大pH值(優選大約9.5或更大pH值)的緩沖劑和離子型表面活性劑，以獲得具有大約9.0或更大pH值(優選大約9.5或更大pH值)的溶液；以及孵育該溶液充分長到足以裂解真核細胞(尤其是動物細胞)的時間段。在具體實施例中，該樣品是血樣，例如像全血。優選地，該樣品是脊椎動物樣品，更優選哺乳動物樣品，尤其是家養動物、役用動物或農場動物樣品，并且最優選地是人類樣品O在其他具體實施例中，這些微生物是細菌和/或單細胞真菌。本專利技術的方法也可以適合于檢測單細胞真核病原體，如有鞭毛的原生動物(flagellated protozoan)或頂復門寄生蟲(apicomplexan parasite)。根據具體實施例，添加的表面活性劑和添加的緩沖劑的體積與樣品體積之間的比率是在2/本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞的方法，所述方法包括以下步驟：?a）提供一種含有或疑似含有微生物的具有真核細胞的樣品，?b）向所述樣品添加一種離子型表面活性劑和一種緩沖劑，以獲得具有大約9.0或更高的pH的溶液，?c）孵育所述溶液持續充分長到足以裂解這些真核細胞的時間段。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.06.06 EP 11305692.31.一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞的方法，所述方法包括以下步驟: _a)提供一種含有或疑似含有微生物的具有真核細胞的樣品， -b)向所述樣品添加一種離子型表面活性劑和一種緩沖劑，以獲得具有大約9.0或更高的PH的溶液， -c)孵育所述溶液持續充分長到足以裂解這些真核細胞的時間段。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品是一種哺乳動物血樣。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述血樣是全血。4.根據權利要求1到3中任一項所述的方法，其中所述微生物選自下組，該組由以下各項組成:細菌和真菌。5.根據權利要求1到4中任一項所述的方法，其中所述孵育步驟c)進行30秒到10分鐘。6.根據權利要求1到5中任一項所述的方法，其中所添加洗滌劑和所添加緩沖劑的體積與樣品體積之間的比率在2/1與1/10之間。7.根據權利要求1到6中任一項所述的方法，其中該離子洗滌劑是是以0.1%到5%(w/v%或v/v%)濃度在溶液中存在。8.根據權利`要求1到7中任一項所述的方法，其中該離子型表面活性劑選自下組，該組由以下各項組成:陰離子型表面活性劑和陽離子型表面活性劑，該陰離子型表面活性劑優選地選自下組，該組由以下各項組成:烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、多庫酯鹽、磺酸鹽氟表面活性劑、烷基苯磺酸鹽、烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽、烷基羧酸鹽以及羧酸鹽氟表面活性劑，更優選地選自下組，該組由以下各項組成:十二烷基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、正十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基醚硫酸鈉(SLES)、肉豆蘧醇聚醚硫酸鈉、琥珀酸二異辛酯磺酸鈉、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、全氟丁烷磺酸鹽、硬脂酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉、全氟壬酸鹽以及全氟辛酸鹽(PFOA或PFO)，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：伊雷妮·多伯拉爾，西格林德·尼爾肯，保羅·凡德維爾，巴特·凡米爾伯根，羅埃爾·彼得曼，
申請(專利權)人：比奧卡爾齊什股份有限公司，
類型：
國別省市：