本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種翹嘴鲌雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：（1）采集鯉魚精液；（2）對鯉魚精液進(jìn)行紫外線遺傳滅活處理；（3）采集翹嘴鲌成熟卵子，用經(jīng)過紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精液進(jìn)行干法授精；（4）受精卵進(jìn)行冷休克處理后放入孵化容器中進(jìn)行孵化，正常成活的魚苗為雌核發(fā)育魚。本發(fā)明專利技術(shù)采用普通鯉魚的紫外線遺傳滅活精子刺激翹嘴鲌卵子，通過冷休克抑制卵子第二極體釋放促使染色體加倍的方法，成功獲得翹嘴鲌雌核發(fā)育個(gè)體。由于正常存活個(gè)體即為雌核發(fā)育魚，不需要再進(jìn)行后續(xù)的染色體、遺傳標(biāo)記等鑒定分析，顯著簡化了鑒定程序。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種翹嘴鉑雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法
本專利技術(shù)涉及魚類生物技術(shù)，尤其涉及一種翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法。
技術(shù)介紹
翅嘴舶(CWierBasilewsky)是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一。目前，養(yǎng)殖用翹嘴舶大部分仍停留在利用天然親魚或多代選留的養(yǎng)殖種，不僅其養(yǎng)殖性狀未被挖掘，而且由于親本選擇不當(dāng)、近親繁殖等原因，養(yǎng)殖性狀已出現(xiàn)生長緩慢、肉質(zhì)品質(zhì)下降等不同程度的種質(zhì)衰退現(xiàn)象。人工雌核發(fā)育誘導(dǎo)是魚類快速固定母本性狀和進(jìn)行性別控制的重要技術(shù)手段，可加快魚類尤其是世代周期較長魚類的育種進(jìn)程和效率。已有研究表明，經(jīng)過一次人工雌核發(fā)育誘導(dǎo)約相當(dāng)于14世代全同胞交配選育，多數(shù)魚類經(jīng)過連續(xù)兩次雌核發(fā)育就可以作為品系(種)親本用于育種生產(chǎn)。然而，魚類雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法常因種類和選用的刺激源不同而有所差異。選擇遺傳距離較遠(yuǎn)且雜交不育的魚類精子作為激活源，不僅可獲得大量雌核發(fā)育魚，而且子代易于鑒別，是一種良好的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法。前期，我們開展了鯉魚與翹嘴舶的雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明，鯉魚精子能激活翹嘴舶卵子發(fā)育，但因染色體數(shù)目不匹配等原因，孵化出膜仔魚多數(shù)畸形且出膜不久后死亡，顯示鯉魚可以作為翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)的激活源。目前，有關(guān)翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)仍未見報(bào)道。為此，我們選擇鯉魚精子作為激活，經(jīng)紫外線滅火精子遺傳物質(zhì)，冷休克抑制卵子第二極體釋放，成功建立了翹嘴舶異源雌核誘導(dǎo)方法，并獲得了大量第一代雌核發(fā)育魚和多個(gè)第二代雌核發(fā)育魚家系，為后續(xù)翹嘴舶選育及全雌育種提供 了重要的技術(shù)支撐。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供一種翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，選取鯉魚精子作為激活源，經(jīng)紫外線遺傳滅活，進(jìn)而冷休克處理抑制卵子第二極體釋放，不僅獲得了大批量翹嘴舶雌核發(fā)育魚，而且還極大的簡化雌核發(fā)育魚的鑒定工作。本專利技術(shù)的技術(shù)方案為:一種翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，包括如下步驟: (1)采集鯉魚精液； (2)對鯉魚精液進(jìn)行紫外線遺傳滅活處理；(3)采集翹嘴舶成熟卵子，用經(jīng)過紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精液進(jìn)行干法授精；(4)受精卵進(jìn)行冷休克處理后放入孵化容器中進(jìn)行孵化，正常成活的魚苗即為雌核發(fā)育魚。受精卵于授精后l_6min內(nèi)進(jìn)行10_35min的冷休克處理。受精卵在2-4°C的溫度下進(jìn)行冷休克處理。所述受精卵授精后4分鐘進(jìn)行冷休克處理。所述受精卵進(jìn)行冷休克處理的最佳時(shí)間為15分鐘。鯉魚精子在進(jìn)行紫外線遺傳滅活處理時(shí)，處理到60-70%的鯉魚精子仍具有活力后停止紫外線處理，將處理后的鯉魚精子保存用于第(3 )步的授精。鯉魚精子的紫外線遺傳滅活處理方法為: A、用Hank’s氏液按體積比1:5稀釋鯉魚精子，將稀釋后的鯉魚精子均勻涂在4°C預(yù)冷的培養(yǎng)皿中； B、用紫外線燈對培養(yǎng)皿上的精液進(jìn)行照射，照射過程中緩慢搖動培養(yǎng)皿使照射均勻； C、每隔2-4min觀察精子活力，當(dāng)60-70%的鯉魚精子具有活力時(shí)停止照射。紫外線遺傳滅活處理后的精液保存于4°C的遮光容器中。 用于采集鯉魚精液的雄鯉魚親本為2-3齡，體重0.5 kg以上的健康雄鯉魚。用于采集翹嘴舶卵子的翹嘴舶雌魚親本按以下方式進(jìn)行強(qiáng)化培育: a、將體重1.0kg以上的翹嘴舶進(jìn)行專池培育，雌雄比2:1; b、培育初期投喂膨化配合飼料，后期增投鮮活餌料(野生小雜魚)； C、繁殖季節(jié)時(shí)，挑選雌雄翹嘴舶親本，人工催產(chǎn)后放入催產(chǎn)池中，流水刺激，雌雄比1:2。有益效果: 1.本專利技術(shù)具有較強(qiáng)的可操作性。本專利技術(shù)采用普通鯉魚的紫外線遺傳滅活精子刺激翹嘴舶卵子，通過冷休克抑制卵子第二極體釋放促使染色體加倍的方法，成功獲得翹嘴舶雌核發(fā)育個(gè)體。雌核發(fā)育二倍體仔魚的孵化率和成活率較高。本專利技術(shù)獲得雌核發(fā)育魚苗易于鑒別。正常存活個(gè)體即為雌核發(fā)育魚，不需要再進(jìn)行后續(xù)的染色體、遺傳標(biāo)記等鑒定分析，顯著簡化了鑒定程序。【附圖說明】圖1是采用本專利技術(shù)獲得的翹嘴舶雌核發(fā)育魚的初孵仔魚實(shí)體圖； 圖2是采用本專利技術(shù)獲得的翹嘴舶雌核發(fā)育魚的I冬齡魚種實(shí)體圖； 圖3是采用本專利技術(shù)獲得的翹嘴舶雌核發(fā)育魚的染色體圖 圖4是引物HLJHB01在雌核發(fā)育群體中的擴(kuò)增圖譜； 圖5是引物S129在3個(gè)群體中的擴(kuò)增圖譜； 圖6是鯉魚精子與翹嘴舶卵子雜交獲得的畸形胚胎圖； 圖7是紫外線遺傳滅活后的鯉魚精子與翹嘴舶卵子授精獲得的單倍體胚胎圖。【具體實(shí)施方式】本專利技術(shù)的翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法具體如下: 涉及親本強(qiáng)化培育、人工催產(chǎn)、精子遺傳物質(zhì)失活、受精卵染色體加倍等關(guān)節(jié)環(huán)節(jié)，具體技術(shù)過程及參數(shù)如下: 1.強(qiáng)化培育。獲得性腺發(fā)育良好的翹嘴舶和鯉魚親本是該項(xiàng)技術(shù)專利技術(shù)能否成功的首要條件。12月至翌年I月，從湖泊或池塘中選留3齡以上，無病無傷，體重1.0kg以上的翹嘴舶良種進(jìn)行專池培育，雌雄比2:1。培育期間，初期投喂優(yōu)質(zhì)膨化配合飼料，后期增投一些鮮活餌料，比如鮮活小雜魚以及小規(guī)格的鯽、鳊魚苗等，以保證親魚的營養(yǎng)需求。雄鯉魚親本要求2-3齡，體重0.5 kg以上，體質(zhì)健壯且鱗、鰭完整無病無傷，多套養(yǎng)于團(tuán)頭魴等魚類的親本培育池內(nèi)。人工催產(chǎn)。繁殖季節(jié)，水溫達(dá)到25°C以上時(shí)，挑選性成熟雌雄翹嘴舶親本，要求雌魚卵巢輪廓明顯、體側(cè)鱗片排列疏松、觸摸腹壁有豐滿和松軟的感覺。注射方法一般采用胸腔一次注射，雌魚注射量為(LRH-A2 50 u g+HCG 1200IU)/kg，雄魚注射量減半。注射藥物的親魚放入催產(chǎn)池中，流水刺激，雌雄比1: 2。對于鯉魚而言，若輕壓腹部有乳白色稠狀精液流出，并能很快在水中散開，可不用注射催產(chǎn)藥物，直接采集精液。若挑選的鯉魚精液量少，可參考翹嘴舶激素劑量腹腔注射I次，并進(jìn)行流水刺激。紫外線處理。根據(jù)紫外線使DNA失活的原理和適宜照射劑量不影響精子入卵能力的特點(diǎn)，參考已有文獻(xiàn)，自制紫外線處理裝置I套，主要包括兩支15W的紫外燈和搖床一臺，通過精子稀釋度、精子活力等情況的實(shí)時(shí)觀察，具體確定每次精子遺傳失活的照射時(shí)間。紫外線處理的具體方法為:1)精子的稀釋。人工擠取的鯉魚精液用Hank’s氏液按體積比1:5稀釋，之后均勻涂在4°C預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，精液厚度控制在Imm以內(nèi)，并保存于盛有碎冰塊的容器上。2)精子遺傳物質(zhì)的失活。保持培養(yǎng)皿精液面與燈管的距離為13-14cm，照射時(shí)間控制在30-50min。照射過程中用搖床不停地緩慢搖動培養(yǎng)皿，以使精子被均勻照射，且每隔一段時(shí)間手工搖動幾次。當(dāng)快達(dá)到適宜的照射劑量時(shí)，每隔2-4min在顯微鏡下觀察精子活力以決定照射的時(shí)間長度。當(dāng)60-70%的鯉魚精子仍具有活力時(shí)，停止照射，完成紫外線滅活處理。處理過的精液保存于4°C的遮光容器中備用。染色體加倍。影響卵子染色體加倍的主要因素有處理溫度、起始時(shí)間和處理持續(xù)時(shí)間。因野外條件下，對水溫梯度的控制比較難，但在一定環(huán)境條件下，冰水混合物能維持較長一段時(shí)間的溫度穩(wěn)定，故選擇處理溫度范圍控制在2-4°C。(I)處理起始時(shí)間。翹嘴舶親魚發(fā)情時(shí)，親魚水面形成波紋，雌、雄魚有時(shí)翻騰水面，急速追逐，這時(shí)分別起網(wǎng)捕魚，采集翹嘴舶成熟卵子，用事先準(zhǔn)備好的遺傳滅活的鯉魚精子進(jìn)行干法授精，并分別于授精后1、2、3、4、5和6min處理受精卵，水溫2_4°C左右，持續(xù)處理時(shí)間14min，通過胚胎孵化率、成活率及畸形率的比較，結(jié)果表明，受精卵于授精后1-6min進(jìn)行冷休克處理14分鐘，均可本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種翹嘴鲌雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：（1）采集鯉魚精液；（2）對鯉魚精液進(jìn)行紫外線遺傳滅活處理；（3）采集翹嘴鲌成熟卵子，用經(jīng)過紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精液進(jìn)行干法授精；（4）受精卵進(jìn)行冷休克處理后放入孵化容器中進(jìn)行孵化，正常成活的魚苗為雌核發(fā)育魚。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，包括如下步驟:(1)采集鯉魚精液；(2)對鯉魚精液進(jìn)行紫外線遺傳滅活處理；(3)采集翹嘴舶成熟卵子，用經(jīng)過紫外線遺傳滅活處理后的鯉魚精液進(jìn)行干法授精；(4)受精卵進(jìn)行冷休克處理后放入孵化容器中進(jìn)行孵化，正常成活的魚苗為雌核發(fā)育魚。2.如權(quán)利要求1所述的翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于，受精卵于授精后 l-6min內(nèi)進(jìn)行10_35min的冷休克處理。3.如權(quán)利要求1所述的翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于，受精卵在2-4°C的溫度下進(jìn)行冷休克處理。4.如權(quán)利要求2所述的翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述受精卵授精后4分鐘進(jìn)行冷休克處理。5.如權(quán)利要求2所述的翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述受精卵進(jìn)行冷休克處理的最佳時(shí)間為15分鐘。6.如權(quán)利要求1所述的翹嘴舶雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，其特征在于，鯉魚精子在進(jìn)行紫外線遺傳滅活處理時(shí)，處理到60-70%的鯉魚精子仍具有活力后停止紫外線處理，將處理后的鯉魚精子保存用于第(3 )步的授精。7.如權(quán)利...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：顧志敏，賈永義，
申請(專利權(quán))人：浙江省淡水水產(chǎn)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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