本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，以太湖藍藻為氮源，以玉米粉為碳源低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶，發(fā)酵制備的蛋白酶最高酶活可達1200U/ml以上，所制備的蛋白酶在有機溶劑中保持著相當高的活性，如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮和甲醇中，其相對活性均在90％以上，既大幅降低了耐有機溶劑蛋白酶的生產(chǎn)成本，又治理了環(huán)境污染，變廢為寶，且所制備的蛋白酶可廣泛應用于洗滌劑、絲綢、造紙、制革與脫毛、環(huán)境修復與保護等領域，屬于生物技術(shù)領域。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)提供的，是以自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，以太湖藍藻為氮源，以玉米粉為碳源低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶的技術(shù)方法，發(fā)酵制備的蛋白酶最高酶活可達1200U/ml以上,所產(chǎn)耐有機溶劑蛋白酶可廣泛應用于洗滌業(yè)、絲綢業(yè)、食品エ業(yè)、造紙業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、皮革與脫毛等領域，屬于生物
。
技術(shù)介紹
蛋白酶是分解蛋白質(zhì)肽鍵的ー類酶，它與人類的生活息息相關，在全球酶制劑銷售總額中，蛋白酶占到60%以上，并有極為廣泛的應用，但其廣泛的應用受生產(chǎn)成本和酶學特性的制約，因此探索蛋白酶的微生物資源、發(fā)酵產(chǎn)酶制備技術(shù)、酶學特性的分析等受到全球許多研究者的關注。目前國內(nèi)外市場上常見的蛋白酶在有機溶劑中容易失活，尤其在親水性有機溶劑中更易失活。另外，一般的耐有機溶劑的蛋白酶的生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶量并不高，而且使用的氮源多為昂貴的蛋白胨、牛肉膏和酪蛋白等，生產(chǎn)成本居高不下，難以大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。藍藻是影響我國淡水質(zhì)量的有害藻類，目前太湖治理藍藻的主要手段是打撈除藻，但造成的次級污染難于處理。藍藻含有豐富的蛋白質(zhì)，如果我們能探索研究出利用藍藻含有豐富的蛋白質(zhì)特性作為原料發(fā)酵生產(chǎn)制備耐有機溶劑的蛋白酶，不僅可以充分利用廢棄物，治理太湖打撈出的藍藻造成的次級環(huán)境污染，還能大幅降低發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶的生產(chǎn)成本問題，我們就是在這樣的思想指導下，經(jīng)過無數(shù)次的實驗探索終于研究出。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了，專利技術(shù)了以太湖藍藻為氮源、以玉米粉為碳源低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶相關的種子培養(yǎng)基配方、產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方及發(fā)酵產(chǎn)酶的技術(shù)參數(shù)，所制備的耐有機溶劑蛋白酶發(fā)酵液粗酶活最高酶活可達1200U/ml以上，所產(chǎn)耐有機溶劑蛋白酶可廣泛應用于洗滌業(yè)、絲綢業(yè)、造紙業(yè)、皮革與脫毛等領域，屬于生物
。本專利技術(shù)的技術(shù)方案:，用我們自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和產(chǎn)酶培養(yǎng)發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶，エ藝為:(I)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基:牛肉膏5g/L，魚蛋白胨10g/L, NaCl 5g/L，pH 7.2 ；取250ml的三角瓶若干個，每個裝種子培養(yǎng)基50ml，121°C滅菌30分鐘，冷卻；在姆個裝種子培養(yǎng)基50ml的三角瓶中挑取一環(huán)菌接入，置于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件--溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)10小時即為發(fā)酵種子液；(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:藍藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸鋅0.15g/L，初始PH = 7.0，泡敵1.5ml/L ；注:藍藻先65 °C烘干。取產(chǎn)酶培養(yǎng)基5升加入到7升發(fā)酵罐中，121°C滅菌40分鐘，冷卻；按6%的接種量，將300ml發(fā)酵種子液加入到含產(chǎn)酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，設定發(fā)酵參數(shù)，，溫度30°C，pH 7.0，轉(zhuǎn)速2001'/1^11，通氣量1.5，171^11/1，發(fā)酵20小時；(3)脂肪酶液制備將發(fā)酵液用高速冷凍離心機在4°C 10，800g離心IOmin的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液，エ業(yè)大生產(chǎn)可用板框濾機壓濾替代離心機離心；(4)脂肪酶活力的測定酶活力単位定義:1個酶活力単位U為在以下條件下Imin釋放I U g酪氨酸所需要的酪蛋白酶量；取粗酶液100 u L，加入偶聯(lián)酪蛋白溶于pH = 7.8的50mM Tris-HCl緩沖液且濃度為10g/L的偶聯(lián)酪蛋白溶液500 ii L混勻，37°C反應lOmin，再加入濃度為100g/L的三氯こ酸1.9ml終止反應，反應混合液在10080 Xg轉(zhuǎn)速下離心15min，小心吸取上清液，加入濃度為40g/L的NaOH 2ml顯色，·在440nm下比色，并記錄吸光度，計算相應的酪氨酸含量。空白對照以水代替酶液進行測定。本專利技術(shù)的有益效果:一般的耐有機溶劑的蛋白酶的生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶量并不高，而且使用的氮源多為昂貴的蛋白胨、牛肉膏和酪蛋白等，生產(chǎn)成本居高不下，難以大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，本專利技術(shù)提供了，而且使用的氮源為影響我國淡水質(zhì)量的有害藻類ー藍藻，不僅大大降低了生產(chǎn)成本，而且還治理了環(huán)境污染，變廢為寶，且可實現(xiàn)大規(guī)模的エ業(yè)化生產(chǎn)，所制備的蛋白酶:在某些親水性有機溶劑如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮和甲醇中，其相對活性均在90%以上；在其它有機溶劑中，除了有機溶劑四氫呋喃和異丙醇外，相對酶活均在80%以上；因此本專利技術(shù)ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法有廣泛的エ業(yè)使用價值和較顯著的經(jīng)濟效益前景。【具體實施方式】實施例11、從斜面上挑取單菌落，劃線于LB平板培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母浸出汁5g/L，瓊脂20g/L，pH 7.2)中，將平板置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。2、從平板上括取I環(huán)菌種接種到含50ml種子培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，魚蛋白胨IOg/L，NaCl 5g/L，pH 7.2)的250ml的三角瓶中，共接種10瓶，置于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)8小時即為發(fā)酵種子液。3、按6%的接種量，將發(fā)酵種子液300ml加入到含5升產(chǎn)酶培養(yǎng)基(藍藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸鋅0.15g/L，初始？11 = 7.0，泡敵1.51111/1)的7升發(fā)酵罐中，設定發(fā)酵參數(shù)，，溫度30°C，pH 7.0，轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量1.5L/min/L，發(fā)酵20小時取出；4、脂肪酶液制備將發(fā)酵液用高速冷凍離心機在4°C 10，800g離心IOmin的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液，エ業(yè)大生產(chǎn)可用板框濾機壓濾替代離心機離心。5、酶活力的測定酶活力単位定義:1個酶活力単位U為在以下條件下Imin釋放I U g酪氨酸所需要的酪蛋白酶量；取粗酶液100 u L，加入偶聯(lián)酪蛋白溶于pH = 7.8的50mM Tris-HCl緩沖液且濃度為10g/L的偶聯(lián)酪蛋白溶液500 ii L混勻，37°C反應lOmin，再加入濃度為100g/L的三氯こ酸1.9ml終止反應，反應混合液在10080 Xg轉(zhuǎn)速下離心15min，小心吸取上清液，加入濃度為40g/L的NaOH 2ml顯色，在440nm下比色，并記錄吸光度，計算相應的酪氨酸含量。空白對照以水代替酶液進行測定。用上述方法測得粗酶液的酶活為1253U/ml。本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，以太湖藍藻為氮源，以玉米粉為碳源低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶，工藝為：(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，魚蛋白胨10g/L，NaCl?5g/L，pH?7.2；取250ml的三角瓶若干個，每個裝種子培養(yǎng)基50ml，121℃滅菌30分鐘，冷卻；在每個裝種子培養(yǎng)基50ml的三角瓶中挑取一環(huán)菌接入，置于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)10小時即為發(fā)酵種子液；(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：藍藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸鋅0.15g/L，初始PH＝7.0，泡敵1.5ml/L；注：藍藻先65℃烘干。取產(chǎn)酶培養(yǎng)基5升加入到7升發(fā)酵罐中，121℃滅菌40分鐘，冷卻；按6％的接種量，將300ml發(fā)酵種子液加入到含產(chǎn)酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，設定發(fā)酵參數(shù)，，溫度30℃，pH?7.0，轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量1.5，L/min/L，發(fā)酵20小時；(3)脂肪酶液制備將發(fā)酵液用高速冷凍離心機在4℃10,800g離心10min的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液，工業(yè)大生產(chǎn)可用板框濾機壓濾替代離心機離心；(4)脂肪酶活力的測定酶活力單位定義：1個酶活力單位U為在以下條件下1min釋放1μg酪氨酸所需要的酪蛋白酶量；取粗酶液100μg，加入偶聯(lián)酪蛋白溶于pH＝7.8的50mM?Tris?HCl緩沖液且濃度為10g/L的偶聯(lián)酪蛋白溶液500μg混勻，37℃反應10min，再加入濃度為100g/L的三氯乙酸1.9ml終止反應，反應混合液在10080×g轉(zhuǎn)速下離心15min，小心吸取上清液，加入濃度為40g/L的NaOH?2ml顯色，在440nm下比色，并記錄吸光度，計算相應的酪氨酸含量，空白對照以水代替酶液進行測定。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，以太湖藍藻為氮源，以玉米粉為碳源低成本發(fā)酵制備耐有機溶劑蛋白酶，エ藝為: (1)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基:牛肉膏5g/L，魚蛋白胨10g/L, NaCl 5g/L，pH 7.2 ； 取250ml的三角瓶若干個，每個裝種子培養(yǎng)基50ml，121°C滅菌30分鐘，冷卻； 在姆個裝種子培養(yǎng)基50ml的三角瓶中挑取一環(huán)菌接入,置于搖床培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)10小時即為發(fā)酵種子液； (2)產(chǎn)酶培養(yǎng) 產(chǎn)酶培養(yǎng)基:藍藻50g/L，玉米粉20g/L，硫酸鋅0.15g/L，初始PH = 7.0，泡敵1.5ml/L ； 注:藍藻先65°C烘干。 取產(chǎn)酶培養(yǎng)基5升加入到7升發(fā)酵罐中，121°C滅菌40分鐘，冷卻； 按6%的接種量，將300ml發(fā)酵種子液加入到含產(chǎn)酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中， 設定發(fā)酵參...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李洪兵，張峰，張明，
申請(專利權(quán))人：湖南鴻鷹生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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