一種生產1,3-二羥基丙酮工程菌的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種生產1,3-二羥基丙酮工程菌的制備方法，是以產氣氣桿菌(Aerobacter?aerogenes)基因組DNA為模板，運用PCR擴增得到編碼甘油脫氫酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大腸桿菌表達載體pBluescriptSK-上，構建克隆載體pSK-gldA，并在E.ColiＪＭ１０９中成功表達。一種表達1,3-二羥基丙酮的方法，是用含甘油的培養基對本發明專利技術的用于表達1，3-二羥基丙酮的工程菌進行發酵，通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1,3-二羥基丙酮。本發明專利技術的1,3-二羥基丙酮高產重組工程菌的構建方法簡單、產量高、成本低廉。基于上述優點，本發明專利技術的工程菌將在1,3-二羥基丙酮的生物法制備中發揮重要的作用，應用前景廣闊。

【技術實現步驟摘要】
—種生產1 ’ 3- 二羥基丙酮工程菌的制備方法
本專利技術屬于微生物發酵
，涉及一種生產1，3-二羥基丙酮工程菌的制備方法。
技術介紹
I, 3- 二羥基丙酮一種重要的化工、生化原料，醫藥、農藥合成中間體和多功能食品添加劑，用途十分廣泛。二羥基丙酮的合成方法主要有貴重金屬催化氧化法和微生物法。重金屬催化氧化甘油的合成法，由于無法克服催化選擇性差的致命缺點，致使甘油轉化率低于40%，DHA的產率低于25%。工業生產方法目前是利用微生物分批發酵。該法是在菌體生長到適當的時期，利用菌體產生的脫氫酶以甘油為底物進行脫氫反應，產生DHA。用于生產DHA的微生物主要是醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)微生物，尤其是弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖桿菌(GluoonobacterOxydans)。菌種在復蘇后先進行預培養，然后轉發酵罐擴大培養，待菌種達到一定濃度后，接種到含有甘油的發酵培養基當中，經過60-80h的耗氧發酵后，再將發酵液一次放出，經分離純化得到DHA。每一個分批發酵過程都經歷接種、生長繁殖、菌體衰老進而結束發酵，最終提取出產物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌體生長到對數期時，并在產物DHA達到一定水平后，放出部分產物，并補加原料和培養基，這樣就可以減少達到生產水平的生物量的時間，提高底物甘油的利用率，節約成本。分批發酵的特點是微生物所處的環境是不斷變化的，發生雜菌污染，能夠很容易終止操作。在發酵生產中，使用的菌種處于對數生長期，把它們接種到發酵罐新鮮培養基時，幾乎不出現調整期，這樣可在短時間內獲得大量生長旺盛的菌體，有利于縮短生產周期。但該法的主要問題是底物甘油和產物DHA在培養基中的濃度過高時產生了高滲透壓，使得發酵菌體裂解、失活，從而導致DHA的產率難以提高。本專利技術以產氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)基因組DNA為模板,運用PCR擴增得到編碼甘油脫氫酶(⑶H)的基因(gldA)，并克隆到大腸桿菌表達載體pBluescript SK—上，構建克隆載體pSK-gldA，并在E.Coli J M I O 9中成功表達。構建的甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮工業工程菌，在含有甘油的培養基中發酵合成1，3-二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3-二羥基丙酮。合成工藝路線簡捷，既節能又環保，所獲得的產品質量高和成本低，總質量收率達到75%以上。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種生產1，3- 二羥基丙酮的重組工程菌的制備方法。本專利技術通過下述方法實現的: 以產氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)基因組DNA為模板,運用PCR擴增得到編碼甘油脫氫酶(⑶H)的基因(gldA)，并克隆到大腸桿菌表達載體pBluescript SK—上，構建克隆載體pSK-gldA，并在E.Coli J M I O 9中成功表達。構建的甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮工業工程菌，在含有甘油的培養基中發酵合成1，3-二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3- 二羥基丙酮。 質粒子及菌株: 克隆載體pBluescript SK_,大腸桿菌E.Coli JMlO 9購自商業公司。限制性內切酶，Taq酶，T4 DNA連接酶均購自大連寶生物公司。其他化學試劑為國產分析純化學試劑。產氣氣桿菌分離培養基:蒸餾水1000mL,甘油5g，NaCl 5g，酵母粉5 g，葡萄糖20g,瓊脂粉15g,調ρΗ7.0，0.IMPa滅菌20min.冷卻至35°C~45°C，加入尼爾紅(Nile Red)2mL/L(0.30mg Nile Red溶于IOOmL 二甲基亞砜),無菌條件下倒入培養皿,冷卻后備用。富營養培養基:蒸餾水1000mL,酵母粉10 g,瓊脂粉10g，甘油3g，(NH4)2SO45g,調 pH7.0,0.1MPa 滅菌 IOmin.產品發酵培養基: 磷酸鹽緩沖液的配制:蒸餾水 1000mL, NaH2PO4.1ffi2O 8.95g，KH2PO4 1.5g, ρΗ7.00.1MPa 滅菌,15min ~20min,備用。基因工程菌富集培養基為LB培養基。發酵培養基為添加15.0%甘油的LB培養基，以鼓入空氣作為基因工程菌氧化劑；培養溫度為35°C。產氣氣桿菌脫氫酶基因的獲得與重組質粒的構建: 通過對1，3_ 二羥基丙酮合成酶gldA進行序列分析，設計了保守引物:primer-1:5'-GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3'primer-11:5'-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3'。以產氣氣桿菌基因組DNA為模版擴增得到一個大的片段，從中分析得到DHA合成酶基因1133bp大小的開放閱讀框，根據獲得的序列設計DHA合成酶基因gldA的擴增引物，在上下游分別引入了 XbaI和EcoRI位。對pBluescript SK-和PCR擴增產物進行XbaI和EcoRI雙酶處理，回收后在T4DNA連接酶作用下16°C連續過夜，以備轉化。PCR擴增:97°C預變性 10min，94°C變形60s，58°C退火30s，72°C延伸60-120S，30個循環后72°C延伸IOmin。將gldA基因和載體質粒pBluescript SIT同時進行XbaI和EcoRI雙酶切，酶切后利用T4連接酶將gldA基因連接到質粒pBluescript SIT中，得重組質粒pSK-gldA。大腸桿菌感受態細胞的制備與轉化:根據《分子克隆實驗指南》鈣法制備大腸桿菌感受態細胞并進行轉化，轉化后接于ImlLB培養集中36°C、150r/min振蕩培養2h，均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上篩選重組大腸桿菌。篩選得到的菌株利用菌落PCR和限制性內切酶酶切重組質粒驗證重組子。產氣氣桿菌發酵及DHA的提取: 前培養是在L-試管中，以無菌操作加入5ml富營養培養基，以無菌牙簽接入產氣氣桿菌的單菌落。35°C、120r/min培養15h。將前培養物0.5ml接種至含有100ml富營養培養基的500ml三角瓶中，300C、130r/min振蕩培養24h。4°C，6000*g無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，然后在4°C，6000*g無菌離心12min，棄上清。將前培養物0.5ml接種至含有100ml富營養培養基的500ml三角瓶中，35°C、130r/min振蕩培養24h。4°C，6000*g無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，再次在4°C，6000*g無菌離心12min，棄上清。在分別將不含有富營養培養基的菌體無菌接入10瓶含有IOOm發酵培養基的500ml三角瓶中，30°C~37°C、130r/min振蕩培養72h。重組大腸桿菌發酵生產1，3- 二羥基丙酮: -70°C保藏的重組大腸桿菌在LB培養基平板上活化，以滅菌牙簽挑取單菌落接于20mlLB培養基中，30°C~37°C培養過夜，以2%的接種量接種于發酵培養基中，加入I~2mmo本文檔來自技高網...

【技術保護點】
本專利技術涉及一種生產1,3?二羥基丙酮工程菌的制備方法，包括：（1）以產氣氣桿菌(Aerobacter?aerogenes)基因組DNA為模板，運用PCR擴增得到編碼甘油脫氫酶（GDH）的基因（gldA）；（2）克隆到大腸桿菌表達載體pBluescript?SK?上，構建克隆載體pSK?gldA；（3）pSK?gldA在E.Coli?ＪＭ１０９中表達。

【技術特征摘要】
1.本發明涉及一種生產1，3-二羥基丙酮工程菌的制備方法，包括: (1)以產氣氣桿菌(Aerobacteraerogenes)基因組DNA為模板,運用PCR擴增得到編碼甘油脫氫酶(GDH)的基因(gldA)； (2)克隆到大腸桿菌表達載體pBluescriptSIT上,構建克隆載體pSK-gldA ； (3)pSK-gldA 在 Ε.Coli JMlO 9 中表達。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于PCR擴增條件為:97°C預變性10min，94°C變形60s, 58°C退火30s, 72°C延伸60_120s，30個循環后72°C延伸IOmin03...

【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：安徽瑞賽生化科技有限公司，
類型：發明
國別省市：