本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白及其應(yīng)用，該重組蛋白疫苗包括以下EDA，ΔNS3以及3個HCVmulti-epitopes：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。HCVEDA-ΔNS3-VAL-44蛋白可以誘導出特異性的體液免疫應(yīng)答以及T細胞免疫應(yīng)答，T細胞經(jīng)過特異性抗原刺激以后可以迅速產(chǎn)生IFN-γ并產(chǎn)生高效的CTL，該種HCV多表位肽及其與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗可能是較理想的HCV預防/治療性候選疫苗。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
—種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于HCV疫苗
，涉及一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
丙型肝炎病毒(h印atitis C virus，HCV)，為黃病毒屬的單股正鏈嗜肝RNA病毒，是引發(fā)慢性肝病的主要病原體，全球約有1.7億感染者，發(fā)病人數(shù)以每年三百萬速度遞增。慢性HCV感染與肝硬化和肝癌直接相關(guān)，嚴重影響患者生活質(zhì)量。由于HCV標準治療方案費用高昂，療效不理想使得發(fā)展中國家大多數(shù)HCV感染患者難以承受。因此研發(fā)HCV疫苗成為降低HCV所引發(fā)的肝硬化，肝癌發(fā)生率最為有效的策略之一。HCV基因組分別編碼核心蛋白C，包膜蛋白El、E2，p7和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3，NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但由于HCV病毒RNA聚合酶缺乏校對功能，病毒變異率高，尤其是位于包膜糖蛋白E2的中和抗原位點存在高變區(qū)，傳統(tǒng)的以產(chǎn)生保護性抗體為主的疫苗研發(fā)面臨重重困難。研究表明，急性病患體內(nèi)多特異性CTL可以使病情逐漸轉(zhuǎn)歸、自愈。慢性HCV病人T細胞應(yīng)答雖然具有多克隆以及多特異性，但強度遠不如急性病人的免疫應(yīng)答強烈，相對較弱的抗HCV免疫應(yīng)答導致病毒難以被清除。與此同時，肝內(nèi)大量的HCV特異性CD8+T細胞分泌Y干擾素的水平受到抑制，因此，慢性HCV感染時CD8+T細胞功能障礙是造成免疫系統(tǒng)不能控制HCV復制，導致疾病慢性化的主要原因。 近10年來，對HCV感染發(fā)病機制、保護性免疫應(yīng)答和病毒持續(xù)感染機制的認識取得了較大進展。中和抗體以及CD4+和CD8+T細胞所引發(fā)強烈的T細胞免疫應(yīng)答已被證明與HCV的清除相關(guān)，這將是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。大量證據(jù)表明，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白介導的持續(xù)性、強烈的、多特異性的Thl型細胞免疫應(yīng)答水平直接關(guān)系到病毒是否能被清除以及疾病的預后。由于大多數(shù)慢性患者HCV亞型的差異，成功的疫苗應(yīng)該誘導產(chǎn)生強烈的多特異性免疫應(yīng)答，包括CD4+及CD8+T細胞免疫應(yīng)答。因此，HCV表位疫苗更傾向于選取保守區(qū)域。本研究前期將篩選出的HCV 2個CTL表位:NS5A(1991-1999) VLSDFKVWL以及NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL,加入一個通用 Th 表位 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL 進行了不同的組合，包括是否含有Th表位，共合成了 8條不同排列組合方式的多肽，經(jīng)過小鼠體內(nèi)試驗，合成肽與HLA-A*0201相對親和力和穩(wěn)定性檢測以及與HCV病人PBMC相作用3部分實驗初步確定了 VLSDFKVWLKKKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLKKSMMAF SAAL (簡稱VAL-44)這種排列組合方式效果最優(yōu)，將這種HCV多肽疫苗皮下免疫HHD-2小鼠后，可以引起脾細胞增殖，⑶4+、⑶8+T淋巴細胞百分比增高以及以Thl型反應(yīng)為主的細胞免疫應(yīng)答，但總體來說，免疫效果尚不十分理想，為了克服肽疫苗免疫源性較弱的缺陷，我們最終選擇了纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A (Fibronectin Extra Domain A,EDA),聯(lián)合截短的NS3插入到3個多表位的上游，構(gòu)建起EDA-ANS3-VAL-44原核表達載體，經(jīng)過誘導蛋白表達，純化得到EDA- A NS3-VAL-44目的蛋白，輔以能夠活化To 11樣受體 3 的免疫佐劑 poly (1: C) (Yu-sheng Cheng and Feng Xu.Anticancer function ofpolyinosinic-polycytidylic acid.Cancer Biology & Therapy.2010;10:1219-1223)對小鼠進行免疫。 纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A (Fibronectin Extra Domain A, EDA)是一種DC活化因子，主要起著募集DC并激發(fā)其成熟的作用；EDA通過與Toll樣受體4相互作用產(chǎn)生共刺激因子，使DC遷移至淋巴結(jié)，輔助DC發(fā)揮較強的攝取加工抗原的作用，并誘導DC成熟，從而激活抗病毒以及抗腫瘤的T細胞應(yīng)答(Mansilla C，Gorraiz M, Martinez M, CasaresN， Arribillaga L, Rudilla F， et al.1mmunization against hepatitis C viruswith a fusion protein containing the extra domain A from fibronectin and thehepatitis C virus NS3 protein.Journal of Hepatology.2009; 51:520-7.)? 由于DC細胞的成熟是效應(yīng)T細胞啟動的必要環(huán)節(jié)，目前多種活化DC的分子成為疫苗研發(fā)的熱點。近幾年，相繼有將抗原與不同促DC成熟刺激物混合的免疫策略，并發(fā)現(xiàn)在這些刺激物的作用下可以激發(fā)更為顯著的免疫應(yīng)答(Liu QH, Bohlen H，Titzer S，Christensen0, Diehl V, Hescheler J, et al.Expression and a role of functionally coupledP2Y receptors in human dendritic cells.FEBS Lett.1999;445:402-8.和 SchwarzK, Storni T, Manolova V, Didierlaurent A, Sirard JC, Rothlisberger P, et al.Role of Toll-like receptors in costimulating cytotoxic T cell responses.Eur JImmunol.2003;33:1465-70.和Resta R, Yamashita Y, Thompson LF.Ecto-enzyme andsignaling functions of lymphocyte CD73.1mmunol Rev.1998;161:95-109.XHCV NS3蛋白編碼基因全長共1893個核苷酸。截短的NS3是編碼絲氨酸蛋白酶區(qū)域，該區(qū)域在多聚蛋白前體的加工和成熟方面起著非常重要的作用。針對NS3的CD4+T細胞免疫應(yīng)答能夠有效刺激IFN- y的生成，增強對IFN- a治療的敏感性，與HCV感染的自限性和良好轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，14例HCV感染患者中的8例自限性患者均具有NS3特異性免疫應(yīng)答，而65例發(fā)展為慢性丙型肝炎的患者中僅有5例具有NS3特異性免疫應(yīng)答，提示抗NS3免疫應(yīng)答與病毒的清除相關(guān)(Di印older HM, Zachoval R, HoffmannRM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, et al.Possible mechanism involvingT-1ymphocyte response to non—structural protein 3 in viral clearance in acutehepatitis C 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，其特征在于：包括以下纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A，ΔNS3以及VAL?44：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗，其特征在于:包括以下纖連蛋白外部結(jié)構(gòu)域A，ANS3以及VAL-44:其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HCV多表位肽與截短型NS3、DC活化分子EDA重組蛋白疫苗在制備針對丙型肝炎病毒的預防性/治療性疫苗的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HCV多表位肽與截...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃小軍，呂欣，尹文，雷迎峰，張瑞國，楊敬，姚敏，賈戰(zhàn)生，蘭海云，張建敏，曲萍，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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