本發明專利技術公開了一種新的產N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌及構建方法和應用，該工程菌是通過將編碼6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因和N-乙酰神經氨酸合成酶基因導入大腸桿菌表達，把大腸桿菌自身的6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因加強表達，并敲除大腸桿菌中的N-乙酰神經氨酸分解利用代謝途徑酶的基因構建而成的重組大腸桿菌。本發明專利技術得到的工程菌株可用于利用葡萄糖或甘油為底物進行發酵培養合成N-乙酰神經氨酸。
【技術實現步驟摘要】
一種新的產N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌及其構建方法和應用
本專利技術涉及一種新的產N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌及其構建方法和應用， 屬生物工程
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技術介紹
唾液酸是指一系列含有9個碳原子并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖，系統命名為 5-氨基_3，5- 二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。唾液酸在自然界中分布廣泛，已經發現許多生物體內都有唾液酸的存在，目前發現的唾液酸已有50余種，N-乙酰-D-神經氨酸 (Neu5Ac)是唾液酸的主要種類，它的含量占整個唾液酸家族的99%以上，通常以α -糖苷的形式位于非還原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。近些年來，唾液酸已經越來越多的受到人們的關注，唾液酸已經成功在食品、醫藥和疾病診斷等領域得到應用，添加到嬰兒奶粉中可以提高嬰兒的智力和記憶力，提高其免疫能力。添加到飲料中可以預防感冒，增加腸道對維生素及礦物質的吸收。可以作為抗流感病毒藥物合成的前體物質，對于肝病及腫瘤等的診斷具有重要價值。從1964年Blix發現唾液酸至今，人們已經發現了多種唾液酸的生產方法，尤其是生產唾液酸中主成分N-乙酰神經氨酸的一些方法，包括天然原料提取法、化學合成法、酶催化法和發酵法等。其中天然原料提取法可得到高質量無污染的唾液酸產品，但由于天然原料中唾液酸含量極低，導致該方法唾液酸的生產成本居高不下，限制了其大面積推廣應用。化學合成、酶催化在生產過程中需要添加昂貴的原料和有害的有機溶劑，導致其生產出來的唾液酸往往只能用于藥物的合成，而無法應用于食品和保健品。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種新的產N-乙酰神經氨酸基因工程菌及其構建方法和應用。本專利技術通過構建新的高產N-乙酰神經氨酸的基因工程大腸桿菌，提高了 N-乙酰神經氨酸的產量。 為解決上述技術問題，本專利技術的產N-乙酰神經氨酸代謝工程菌，首先是通過引入并高表達6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因(GNA1)、N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因(AGE) 和N-乙酰神經氨酸合成酶基因(neuB)，架構起從葡萄糖到N-乙酰神經氨酸的合成通路， 實現利用葡萄糖合成N-乙酰神經氨酸的目的。為了提高N-乙酰神經氨酸的產量，高表達了 6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因(nagB)以提高前體物氨基葡萄糖的供應量。為進一步提高N-乙酰神經氨酸的產率，還可以敲除該代謝工程菌中的N-乙酰神經氨酸分解利用代謝途徑酶的基因。在一個實施方案中，本專利技術的工程菌敲除乙酰葡萄糖胺脫乙酰酶編碼基因 (nagA)以避免中間產物N-乙酰葡萄糖胺的分解；敲除N-乙酰神經氨酸分解代謝基因簇 nanATEK,阻斷N-乙酰神經氨酸的降解，達到在胞外積累終產物N-乙酰神經氨酸的目的。詳見附圖1。所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因來源于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或能表達相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據GenBank N0.NM_001179949基因序列全基因合成，或利用釀酒酵母(如菌株S288C)的基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。所述N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因來源于魚腥藻(Anabaena)或能表達相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據GenBank N0.DQ661858基因序列全基因合成，或利用魚腥藻(如藻株Anabaena sp.CHl)的基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。所述N-乙酰神經氨酸合成酶基因來源于空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或能表達相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據GenBank N0.AF400048基因序列全基因合成，或利用空腸彎曲菌(如菌株ATCC43438)的基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。 所述6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因來源于大腸桿菌或能表達相同功能酶的微生物，6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因的獲得可根據大腸桿菌W3110基因組GenBankN0.NC_007779的中的nagB基因序列，經全基因合成得到，或利用大腸桿菌基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因(GNA1)、N-乙酰葡萄糖胺_2_異構酶基因(AGE)、N-乙酰神經氨酸合成酶基因(neuB)和6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因(nagB)導入大腸桿菌并高表達，是將這四個基因克隆到表達載體上后，以質粒的方式在大腸桿菌中表達。所述的乙酰葡萄糖胺脫乙酰酶編碼基因(nagA)為大腸桿菌自身基因組所有，能將6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺分解為6-磷酸葡萄糖胺，不利于N-乙酰神經氨酸前體物6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺的積累，并影響最終N-乙酰神經氨酸的產量。所述分解N-乙酰神經氨酸的nanATEK基因簇為大腸桿菌自身基因組中所有，包含了四個基因，分別為:N-乙酰神經氨酸醛縮酶編碼基因nanA、N-乙酰神經氨酸轉運蛋白編碼基因nanT、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺異構酶編碼基因nanE和N-乙酰甘露糖胺激酶編碼基因nanK，這四個基因能將N-乙酰神經氨酸從胞外轉運至胞內并分解，不利于N-乙酰神經氨酸的積累，具體可參見附圖1。本專利技術還公開了上述產N-乙酰神經氨酸代謝工程菌的構建方法，具體步驟包括:將nagB、GNAU AGE和neuB基因分別克隆到表達載體上，轉入大腸桿菌中，獲得高產N-乙酰神經氨酸代謝工程菌。其中所述四個基因可分別克隆至4個表達載體中，也可以以任何方式組合分別克隆至3個表達載體中，或者以以任何方式組合分別克隆至2個表達載體中。更特別地，可將所述四個基因克隆至一個表達載體中。在一個特別的實施方案中，所述構建方法更加具體的步驟包括:I)克隆6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因(nagB)至表達載體1，以實現該基因的高表達；2)克隆6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因(GNA1)至I)獲得的表達載體上，獲得雙基因表達載體，以實現兩個基因的聞表達；3)克隆N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因(AGE)至表達載體2 (載體I和2須能共存于同一宿主菌)，以實現該基因的聞表達；4)克隆N-乙酰神經氨酸合成酶基因(neuB)至3)獲得的表達載體上，獲得雙基因表達載體，以實現兩個基因的聞表達；5)將2)和4)中獲得的雙基因表達載體轉化大腸桿菌菌株中，獲得產N-乙酰神經氨酸代謝工程菌在另一實施方案中，先敲除大腸桿菌中的分解N-乙酰神經氨酸的nanATEK基因簇和分解6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺的nagA基因，將nagB、GNAl、AGE和neuB基因分別克隆到表達載體上，轉入敲除了 nanATEK基因簇和nagA基因的大腸桿菌中，獲得高產N-乙酰神經氨酸代謝工程菌。其中所述四個基因可分別克隆至4個表達載體中，也可以以任何方式組合分別克隆至3個表達載體中，或者以以任何方式組合分別克隆至2個表達載體中。更特別地，可將所述四個基因克隆至一個表達載體中。在一個特別的實施方案中，該構建方法更加具體的步驟包括:I)敲除上述大腸桿菌中的nagA基因，獲得nagA失活的菌株；2)敲除大腸桿菌中的基因簇nanATEK，獲得基因簇nanATEK和nagA失活的菌株；3)克隆6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因(nagB)至表本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種產N?乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌，其特征在于所述工程菌是通過將6?磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N?乙酰葡萄糖胺?2?異構酶基因、N?乙酰神經氨酸合成酶基因和6?磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因導入大腸桿菌表達構建而成的重組大腸桿菌。
【技術特征摘要】
1.一種產N-乙酰神經氨酸大腸桿菌工程菌，其特征在于所述工程菌是通過將6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因、N-乙酰神經氨酸合成酶基因和 6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因導入大腸桿菌表達構建而成的重組大腸桿菌。2.根據權利要求1所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述大腸桿菌還敲除了N-乙酰神經氨酸分解利用代謝途徑酶的基因。3.根據權利要求2所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述N-乙酰神經氨酸分解利用代謝途徑酶的基因包括編碼6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺脫乙酰酶的基因nagA、編碼N-乙酰神經氨酸醛縮酶的基因nanA、編碼N-乙酰神經氨酸轉運蛋白的基因nanT、編碼N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺異構酶的基因nanE和編碼N-乙酰甘露糖胺激酶的基因nanK，其中前述后四個基因連在一起，構成一個基因簇nanATEK。4.根據權利要求1至3任一項權利要求所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-異構酶基因、N-乙酰神經氨酸合成酶基因和6-磷酸葡萄糖胺脫氨酶基因導入大腸桿菌并高表達，是將這四個基因克隆到質粒表達載體上后，以質粒的方式在大腸桿囷中表達。5.根據權利要求1至3任一項權利要求所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述6-磷酸葡萄糖胺...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳鵬福，孫立潔，王紀，袁麗霞，劉洋，吳金勇，陳祥松，史吉平，姚建銘，
申請(專利權)人：武漢中科光谷綠色生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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