本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種食品級(jí)中性蛋白酶的提純方法，包括如下步驟：1）采用枯草芽孢桿菌AS1.398菌種發(fā)酵，得到中性蛋白酶發(fā)酵液；往發(fā)酵液中添加絮凝劑；2）板框過濾：將中性蛋白酶發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾收集濾液；3）離心：將板框過濾收集的濾液進(jìn)行高速離心；4）粗濾：將收集的離心液進(jìn)行粗濾；5）精濾：采用聚砜超濾膜進(jìn)行過濾濃縮；6）添加酶活保護(hù)劑：添加海藻糖和β-環(huán)狀糊精；7）沉淀:添加食用乙醇，收集中性蛋白酶沉淀部分；8）真空干燥：真空干燥，即可得到食品級(jí)中性蛋白酶。本發(fā)明專利技術(shù)能有效的解決中性蛋白酶活損失問題，酶活收率明顯提高，成品提取總收率達(dá)到70%以上，衛(wèi)生指標(biāo)符合食品級(jí)要求，可應(yīng)用于食品加工行業(yè)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
，具體涉及。
技術(shù)介紹
目前，工業(yè)上采用枯草芽孢桿菌ASl.398生產(chǎn)中性蛋白酶已有多年的歷史，是一類被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的酶類，在洗滌劑、制革、絲綢、食品加工等多種行業(yè)上有著廣泛的用途。目前我國發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶工藝主要是發(fā)酵液直接噴霧干燥或鹽析沉淀后再烘干，此類產(chǎn)品由于生產(chǎn)工藝過程的局限性，酶活在高溫環(huán)境損失較大，酶活收率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多，微生物等衛(wèi)生指標(biāo)不符合食品行業(yè)要求，應(yīng)用范圍受限制，因此對(duì)發(fā)酵液中性蛋白酶的分離、提純很有必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供，能有效的解決中性蛋白酶活損失問題，酶活收率明顯提高，提取總收率達(dá)到70%以上；所得到的食品級(jí)中性蛋白酶的純度和酶活都比工業(yè)用酶高，衛(wèi)生指標(biāo)符合食品級(jí)要求，可應(yīng)用于食品加工行業(yè)，產(chǎn)品附加值得到提升。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到:一種食品級(jí)中性 蛋白酶的提純方法，其特征在于包括如下步驟:I)采用枯草芽孢桿菌ASl.398菌種進(jìn)行發(fā)酵，得到中性蛋白酶發(fā)酵液；然后往發(fā)酵液中添加絮凝劑，攪拌均勻，靜置30分鐘，使雜質(zhì)與絮凝劑結(jié)合成團(tuán)狀；有利于過濾；2)板框過濾:將絮凝反應(yīng)完成后的中性蛋白酶發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾，過濾壓力控制在0.6-0.8MPa，收集濾液；3)離心:將板框過濾收集的濾液進(jìn)行高速離心，轉(zhuǎn)速為:10000rpm，進(jìn)料流速為80L/h，收集離心液；4)粗濾:將收集的離心液進(jìn)行粗濾，采用聚偏氟乙烯濾膜進(jìn)行過濾，聚偏氟乙烯濾膜的孔徑為0.22um和0.lum(天津愛生膜過濾技術(shù)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)分別MFO(^PMFIbl),操作壓力0.1MPa ；5)精濾:將經(jīng)過粗濾后的料液采用聚砜超濾膜進(jìn)行過濾濃縮，聚砜超濾膜的截留分子量為IOK (天津愛生膜過濾技術(shù)有限公司生產(chǎn)，濾膜型號(hào)USIbl)，操作壓力0.1MPa ;得到中性蛋白酶濃縮液；目的是過濾除去大部分水和小分子鹽類等物質(zhì)，截留中性蛋白酶分子，起到提純作用；6)添加酶活保護(hù)劑:往步驟5)得到的中性蛋白酶濃縮液中添加酶活保護(hù)劑，攪拌均勻；其中，所述酶活保護(hù)劑包括海藻糖和β_環(huán)狀糊精，所述海藻糖的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.4-1.2%，β -環(huán)狀糊精的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.2-0.6%;7)沉淀:往經(jīng)過步驟6)處理后的中性蛋白酶濃縮液中添加食用乙醇，邊添加邊緩慢攪拌，使得中性蛋白酶分子結(jié)晶沉淀出來，收集絮狀的中性蛋白酶沉淀部分；8)真空干燥:將步驟7)收集得到的絮狀的中性蛋白酶沉淀部分進(jìn)行真空干燥，即可得到食品級(jí)中性蛋白酶。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的目的還可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到:實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式是:在步驟I)中，所述絮凝劑是陰離子聚丙烯酰胺；添加絮凝劑時(shí)，需先將絮凝劑按重量比為1:1000的比例溶解于水中，得到預(yù)溶絮凝液，然后將預(yù)溶絮凝液按重量比為1:100的比例添加到中性蛋白酶發(fā)酵液中，緩慢攪拌10分鐘。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式是:在步驟4)中，要求料液經(jīng)過兩次過濾，濾膜孔徑分別為0.22um和0.lum。以達(dá)到最佳的除雜效果。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式是:在步驟6)中，所述海藻糖的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.8-1.2%，β -環(huán)狀糊精的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.5%。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式是:在步驟6)中，所述海藻糖的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.8%，β -環(huán)狀糊精的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.5%。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式是:在步驟7)中，所述食用乙醇的濃度為90% ;添加定量的濃度為90%的食用乙醇，使得最終的中性蛋白酶濃縮液中含食用乙醇的重量百分含量為 50%ο本專利技術(shù)的有益效果在于:本專利技術(shù)將菌種ASl.398發(fā)酵液中的中性蛋白酶分離、提純，達(dá)到食品行業(yè)應(yīng)用的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大了中性蛋白酶的使用范圍，提高中性蛋白酶的使用價(jià)值，為大量生產(chǎn)食品級(jí)中性蛋白酶提供技術(shù)支持。本專利技術(shù)工藝中采用兩次逐級(jí)粗濾，可以將發(fā)酵液中的微生物和雜質(zhì)完全過濾除去，超濾濃縮后的中性蛋白酶溶液，通過添加適當(dāng)酶活保護(hù)劑，減少酶活損失，用乙醇沉淀中性蛋白酶，收集沉淀物，再進(jìn)行真空干燥，即可得到精制中性蛋白酶產(chǎn)品。通過該工藝處理得到的中性蛋白酶產(chǎn)品，純度和酶活都比工業(yè)用酶高，衛(wèi)生指標(biāo)符合食品級(jí)要求，可應(yīng)用于食品加工行業(yè)，產(chǎn)品附加值得到提升?！揪唧w實(shí)施方式】下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步描述:實(shí)施例1:，包括如下步驟:1)采用枯草芽孢桿菌ASl.398菌種進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐為1000L，取出料發(fā)酵液600kg，檢測(cè)發(fā)酵液酶活為6800U/g，得到中性蛋白酶發(fā)酵液；然后往發(fā)酵液中添加絮凝劑，攪拌均勻，靜置30分鐘，使雜質(zhì)與絮凝劑結(jié)合成團(tuán)狀；有利于過濾；所述絮凝劑是陰離子聚丙烯酰胺；添加絮凝劑時(shí)，需先將絮凝劑按重量比為1:1000的比例溶解于水中，得到預(yù)溶絮凝液，然后將預(yù)溶絮凝液按重量比為1:100的比例添加到中性蛋白酶發(fā)酵液中，即將6kg預(yù)溶絮凝液添加到600kg中性蛋白酶發(fā)酵液中，緩慢攪拌10分鐘。2)板框過濾:將絮凝反應(yīng)完成后的中性蛋白酶發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾，過濾壓力控制在0.6-0.8MPa，共收集濾液525kg。3)離心:將板框過濾收集的濾液進(jìn)行高速離心，轉(zhuǎn)速為:10000rpm，進(jìn)料流速為80L/h，收集離心液，得到離心液509kg。4)粗濾:將收集的離心液進(jìn)行粗濾，采用聚偏氟乙烯濾膜進(jìn)行過濾，聚偏氟乙烯濾膜的孔徑分別為0.22um和0.lum，操作壓力0.1MPa ;要求料液經(jīng)過兩次過濾。以達(dá)到最佳的除菌效果。聚偏氟乙烯濾膜選用型號(hào)為MFOc和MFIbl。5)精濾:將經(jīng)過粗濾后的料液采用聚砜超濾膜進(jìn)行過濾濃縮，聚砜超濾膜的截留分子量為10K，操作壓力0.1MPa;得到中性蛋白酶濃縮液115kg，酶活檢測(cè)為2.7萬U/g，酶活收率為76.1%。目的是過濾除去大部分水和小分子糖類、鹽類等物質(zhì)，截留中性蛋白酶分子，起到提純作用；聚砜超濾膜選用型號(hào)為USIbl。6)添加酶活保護(hù)劑:往步驟5)得到的中性蛋白酶濃縮液中添加酶活保護(hù)劑，攪拌均勻；其中，所述酶活保護(hù)劑包括海藻糖和β_環(huán)狀糊精，所述海藻糖的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的1%，即1.15kg，β-環(huán)狀糊精的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.5%，即 0.575kg; 7)沉淀:往經(jīng)過步驟6)處理后的中性蛋白酶濃縮液中添加濃度為90%的食用乙醇，使得最終的中性蛋白酶濃縮液中含食用乙醇的重量百分含量為50%，經(jīng)計(jì)算需添加濃度為90%的食用乙醇145.9kg ;邊添加邊緩慢攪拌，使得中性蛋白酶分子結(jié)晶沉淀出來，收集絮狀的中性蛋白酶沉淀部分。8)真空干燥:將步驟7)收集得到的絮狀的中性蛋白酶沉淀部分進(jìn)行真空干燥，即可得到粉末狀的食品級(jí)中性蛋白酶，重量為3.53kg，酶活為82.4萬U/g，酶活總收率為71.3%。9)中性蛋白酶檢測(cè)方法按照國標(biāo)GB/T23527-2009附錄C紫外分光光度法檢測(cè)。蛋白酶活力定義為:lg固體酶粉(或Iml液體酶)，在一定溫度和PH值下，I分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生Iug酪氨酸，即為I個(gè)酶活力單位，以U/g或u/ml表示。10)微生物指標(biāo)檢測(cè):細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.2-2010菌落總數(shù)測(cè)定，大本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種食品級(jí)中性蛋白酶的提純方法,?其特征在于包括如下步驟：1）采用枯草芽孢桿菌?AS1.398菌種進(jìn)行發(fā)酵，得到中性蛋白酶發(fā)酵液；然后往發(fā)酵液中添加絮凝劑，攪拌均勻，靜置30分鐘，使雜質(zhì)與絮凝劑結(jié)合成團(tuán)狀；?2）板框過濾：將絮凝反應(yīng)完成后的中性蛋白酶發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾，過濾壓力控制在0.6?0.8MPa，收集濾液;3）離心：將板框過濾收集的濾液進(jìn)行高速離心，轉(zhuǎn)速為：10000rpm,進(jìn)料流速為80L/h，收集離心液;4）粗濾：將收集的離心液進(jìn)行粗濾，采用聚偏氟乙烯濾膜進(jìn)行過濾，聚偏氟乙烯濾膜的孔徑為0.22um和0.1um，操作壓力0.1MPa；5）精濾：將經(jīng)過粗濾后的料液采用聚砜超濾膜進(jìn)行過濾濃縮，聚砜超濾膜的截留分子量為10K，操作壓力0.1MPa；得到中性蛋白酶濃縮液；6）添加酶活保護(hù)劑：往步驟5）得到的中性蛋白酶濃縮液中添加酶活保護(hù)劑，攪拌均勻；其中，所述酶活保護(hù)劑包括海藻糖和β?環(huán)狀糊精，所述海藻糖的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.4?1.2%，β?環(huán)狀糊精的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.2?0.6%;7）沉淀:往經(jīng)過步驟6）處理后的中性蛋白酶濃縮液中添加食用乙醇，邊添加邊緩慢攪拌，使得中性蛋白酶分子結(jié)晶沉淀出來，收集絮狀的中性蛋白酶沉淀部分;8）真空干燥：將步驟7）收集得到的絮狀的中性蛋白酶沉淀部分進(jìn)行真空干燥，即可得到食品級(jí)中性蛋白酶。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種食品級(jí)中性蛋白酶的提純方法，其特征在于包括如下步驟: 1)采用枯草芽孢桿菌ASl.398菌種進(jìn)行發(fā)酵，得到中性蛋白酶發(fā)酵液；然后往發(fā)酵液中添加絮凝劑，攪拌均勻，靜置30分鐘，使雜質(zhì)與絮凝劑結(jié)合成團(tuán)狀； 2)板框過濾:將絮凝反應(yīng)完成后的中性蛋白酶發(fā)酵液進(jìn)行板框過濾，過濾壓力控制在0.6-0.8MPa，收集濾液； 3)離心:將板框過濾收集的濾液進(jìn)行高速離心,轉(zhuǎn)速為:10000rpm,進(jìn)料流速為80L/h,收集離心液； 4)粗濾:將收集的離心液進(jìn)行粗濾，采用聚偏氟乙烯濾膜進(jìn)行過濾，聚偏氟乙烯濾膜的孔徑為0.22um和0.1um,操作壓力0.1MPa ； 5)精濾:將經(jīng)過粗濾后的料液采用聚砜超濾膜進(jìn)行過濾濃縮，聚砜超濾膜的截留分子量為10K，操作壓力0.1MPa ;得到中性蛋白酶濃縮液； 6)添加酶活保護(hù)劑:往步驟5)得到的中性蛋白酶濃縮液中添加酶活保護(hù)劑，攪拌均勻；其中，所述酶活保護(hù)劑包括海藻糖和β_環(huán)狀糊精，所述海藻糖的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.4-1.2%，β -環(huán)狀糊精的重量為中性蛋白酶濃縮液的重量的0.2-0.6%; 7)沉淀:往經(jīng)過步驟6)處理后的中性蛋白酶濃縮液中添加食用乙醇，邊添加邊緩慢攪拌，使得中性蛋白酶分子結(jié)晶沉淀出來，收集絮狀的中性蛋白酶沉淀部分； 8)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陸祥，陸榮，陸慶，何維，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣州市激力生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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