一種J亞群禽白血病DNA疫苗的構建及應用制造技術

本發明專利技術涉及一種J亞群禽白血病DNA疫苗的構建及應用；本發明專利技術構建了表達雞免疫球蛋白G的Fc片段基因和J亞群禽白血病病毒囊膜蛋白（env蛋白）基因的重組真核表達質粒pcDNA3.1-Fc-env。通過瞬時轉染及間接免疫熒光試驗，證實pcDNA3.1-Fc-env能夠在293T細胞中正確表達。大量提取質粒，質粒純化定量到1mg/ml，然后將重組質粒免疫小鼠，每只100ug，免疫三次，每次間隔兩周。通過檢測血清中ALV-J?env蛋白特異性抗體水平；顯示pcDNA3.1-Fc-env具有預防J亞群禽白血病的作用。

【技術實現步驟摘要】
一種J亞群禽白血病DNA疫苗的構建及應用一、
本專利技術涉及一種J亞群禽白血病DNA疫苗的構建及應用，屬于獸用核酸疫苗領域。二、
技術介紹
J 亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis virus subgroup J, ALV-J)是 1988 年首次從大不列顛白羽肉雞中分離得到的一種禽白血病病毒新的亞群，主要引發白羽肉雞的髓細胞組織增生和腫瘤。ALV-J與A、B亞群一樣，屬于外源性禽白血病病毒，在雞體內既能垂直傳播也能水平傳播，且J亞群水平傳播的速度遠遠高于A、B亞群病毒，該病已迅速蔓延到許多國家，使養雞業面臨一個嚴重問題。 在我國，ALV-J隨著引進的白羽肉種雞帶進了我國白羽肉雞群。在1999年，從市場上的商品代肉雞中首次分離檢測到ALV-J，最早的毒株分別定名為SD9901、SD9902和YZ9901、YZ9902。后來又不斷從其他不同的省份分離到ALV-J。隨后，ALV-J又進一步傳入到我國自主培育的黃羽肉雞、固有型地方品種雞及蛋用型雞。ALV-J不僅給我國規模養雞業帶來很大損失，也威脅到我國歷史上形成的地方雞品種的種質資源庫[1_3]。目前ALV-J的防治沒有商品化的疫苗，主要依靠凈化種雞群的辦法來控制和清除ALV-J。由于養殖環境已被污染，完全實施凈化是艱難和不可能完全實現的。早在20年前，歐美國家就有學者研制雞ALV疫苗，但沒有成功。Brumester等人曾經嘗試研制ALV滅活疫苗，但是發現在滅活病毒的同時，也會使疫苗的免疫原性幾乎隨之喪失，不致病性的ALV弱毒活疫苗的研制也宣告失敗。國外隨著ALV在商品化雞群中被基本凈化，就不再做ALV疫苗的研究了。目前已經證實使用重組的ALV作為疫苗清除或降低ALV感染是可行的。通過表達ALV-A和ALV-J的重組囊膜糖蛋白作為免疫原的亞單位疫苗可作為潛在的疫苗，用于防止ALV的水平傳播。近年來，崔志中等分別實驗了 A、B、J亞群ALV感染細胞的滅火疫苗及病毒中和反應相關的gp85亞單位疫苗的免疫效果。結果表明，機體對不同亞群ALV滅活疫苗或亞單位疫苗的免疫反應性都很差,但經過重復免疫后，還能夠誘發一定水平抗體的形成，而且有助于縮短攻毒后病毒血癥的持續期[4]。env蛋白是ALV三個主要結構蛋白之一，是病毒的囊膜蛋白。env蛋白在與宿主細胞表面的特異性受體結合，是病毒進入宿主細胞復制，誘導腫瘤發生的必須條件，所以從病毒感染細胞、復制和表達以及腫瘤發生的整個過程來看，env蛋白在ALV的致病、致瘤中具有非常重要的作用[5]。因此我們選擇env蛋白作為核酸疫苗的靶基因。核酸疫苗是20世紀90年代后發展起來的新型疫苗之一，具有制備方便、免疫力持久、副作用少并能誘導T細胞和B細胞介導的細胞核體液免疫等優點，但是該疫苗存在產生抗體慢、水平低的缺點，需要有效的佐劑進行克服。目前ALV-J DNA疫苗的開發還未見報道。抗體是一個呈“Y”形的蛋白，Y的上面與抗原表位結合，下面的那一豎又叫Fe，即可結晶片段。在巨噬細胞、樹突狀細胞等細胞表面具有免疫球蛋白G的Fe片段受體。Fe與Fe受體結合，可以讓巨噬細胞吞噬被抗體結合的抗原[6]。本專利就是利用抗體Fe基因表達產物作為分子佐劑，增強env蛋白基因疫苗的免疫效果。三、
技術實現思路
:為了解決上述問題，本專利技術提供了一種J亞群禽白血病DNA疫苗的構建及應用；構建了表達雞免疫球蛋白G的Fe片段基因和J亞群禽白血病病毒囊膜蛋白(env蛋白)基因的重組真核表達質粒pcDNA3.1-Fc-env。通過瞬時轉染及間接免疫熒光試驗，證實pcDNA3.1-Fc-env能夠在293T細胞中正確表達。大量提取質粒，質粒純化定量到lmg/ml，然后將重組質粒免疫小鼠，每只IOOug,免疫三次,每次間隔兩周。在每次免疫一周后小鼠尾部采血,分離血清,檢測血清中ALV-J env蛋白特異性抗體水平。結果顯示pcDNA3.1-Fc-env能夠誘導小鼠產生較高水平的抗體。且隨著免疫次數的增加不斷上升，與空白對照組差異顯著。綜上，pcDNA3.1-Fc-env具有預防J亞群禽白血病的作用。具體的，本專利技術包括以下各項內容:1、一種J亞群禽白血病DNA疫苗，所述J亞群禽白血病DNA疫苗是包含編碼雞免疫球蛋白G的Fe片段基因和J亞群禽白血病病毒囊膜蛋白(env蛋白)基因的重組真核表達質粒。2、所述雞免疫球蛋白 G的Fe片段基因序列如SEQ ID N0.1所示。3、所述J亞群禽白血病病毒囊膜蛋白(env蛋白)基因序列如SEQ ID N0.2所示。4、具有如SEQ ID N0.3所示的序列重組真核表達質粒用作預防J亞群禽白血病DNA疫苗的作用。一種J亞群禽白血病DNA疫苗的制備過程，包括以下步驟:1、雞IgG-Fc基因克隆根據NCBI已發表的雞IgG重鏈序列(X07174.1)，設計引物，在上游引物中加入EcoR I酶切位點和ATG起始密碼子，下游引物去除終止子，通過RT-PCR方法得到雞IgG-Fc基因;2、ALV-J env 基因的克隆按照ALV-J env基因設計引物，上游引物中加入與IgG Fe段互補序列，下游引物中加入Xba I酶切位點，克隆得到ALV-J env基因；3、Fc-env融合基因的擴增將雞IgG-Fc基因和ALV-env基因核酸分別做1000倍稀釋，作為反應的模板，以雞IgG-Fc上游引物和env下游引物作為一對引物進行重疊PCR ;利用限制性內切酶EcoR 1、Xba I酶切pcDNA3.1克隆載體；利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，從膠上回收線形化的載體；利用限制性內切酶EcoR 1、Xba I酶切重疊PCR產物(Fc-env)利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，從膠上回收已切好的Fc-env DNA ;將線形化的載體與回收的DNA片斷用T4DNA連接酶連接過夜即完成重組真核表達質粒pcDNA3.1-Fc-env的構建。將pcDNA3.1-Fc-env轉化大腸桿菌DH5 a，即得到重組大腸埃希氏菌ALVFc(Escherichia coli)。已于2013年9月5日保存到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽區北辰路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編=100101 ;菌種保藏編號為:CGMCC NO:8136。本專利技術的有益效果:將pcDNA3.l_Fc-env肌肉注射小白鼠，可產生抗禽白血病病毒的特異性抗體和細胞免疫。四、【附圖說明】圖lALV-env 基因、IgG Fe 片段基因與 pcDNA3.1 載體構建的 pcDNA3.1-Fc-env酶切鑒定結果:1是pcDNA3.1-Fc-env表達載體雙酶切產物；M是DNA分子量標記8K DNAMarker0本圖顯示pcDNA3.1-Fc-env構建成功及酶切特性。圖2間接免疫熒光檢測pcDNA3.1-Fc-env轉染293T細胞中的表達:A為pcDNA3.1-Fc-env轉染的293T細胞；B為陰性對照本圖顯示pcDNA3.1-Fc-env可表達出重組Fc-env融合蛋白。圖3Env蛋白特異性抗體檢測結果本圖說明pcDNA3.1-Fc-env可誘導抗禽白血病病毒Env特異性抗體。五、【具體實施方式】實施例一 J亞群禽白血病DNA疫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株保藏號為CGMCC?NO:8136的大腸埃希氏菌ALVFc，已于2013年9月5日保存到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

【技術特征摘要】
1.一株保藏號為CGMCC N0:8136的大腸埃希氏菌ALVFc，已于2013年9月5日保存到中國微生物菌種保藏管理委員會普...

【專利技術屬性】
技術研發人員：常維山，崔治中，郭浩，
申請(專利權)人：山東農業大學，
類型：發明
國別省市：