雞β-防御素9酵母工程菌制備及其表達(dá)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了雞β-防御素9酵母工程菌制備及表達(dá)方法，屬于生物技術(shù)及基因工程制藥技術(shù)領(lǐng)域。首先利用畢赤酵母慣用密碼子優(yōu)化雞β-防御素9基因，在其前端添加Kex2酶切位點(diǎn)編碼序列并人工合成該基因，然后將合成的β-防御素9基因序列插入酵母組成型表達(dá)載體，通過(guò)同源重組整合到甲基營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母染色體中，經(jīng)多次篩選得到生產(chǎn)雞β-防御素9的酵母工程菌。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，它能持續(xù)性進(jìn)行蛋白高水平表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量高、更接近天然結(jié)構(gòu)且分泌到發(fā)酵液中，也具有較強(qiáng)的抗食源性病原活性。將發(fā)酵液通過(guò)初步分離，經(jīng)濃縮或干燥后可直接作為飼料添加劑，用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)，降低了防御素的生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明專利技術(shù)為β-防御素9的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用及開(kāi)發(fā)家禽飼料抗生素添加劑替代品奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
雞P-防御素9酵母工程菌制備及其表達(dá)方法
本專利技術(shù)屬于生物技術(shù)及基因工程制藥
，具體涉及一種雞P -防御素9酵母工程菌制備及其表達(dá)方法。
技術(shù)介紹
自20世紀(jì)50年代起，抗生素的亞治療劑量就被添加到飼料中來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。大量抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用，已經(jīng)導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌不斷出現(xiàn)，一些感染性病原體甚至嚴(yán)重威脅到人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。隨著人們關(guān)注度的不斷提高和抗藥性病原的傳播，歐洲已經(jīng)開(kāi)始禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素來(lái)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因此，尋找一種天然的無(wú)污染的能夠替代抗生素的新型飼料添加劑迫在眉睫，它既擁有抗菌功能，又能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，以降低飼養(yǎng)成本。防御素屬于抗菌肽家族的一個(gè)亞族，是廣泛分布于動(dòng)植物界的一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子小肽。防御素具有廣譜抗微生物活性，對(duì)細(xì)菌、真菌、螺旋體、病毒等均有抗性，且病源微生物不易產(chǎn)生耐藥性，是宿主抵抗外來(lái)致病性微生物侵襲的重要防線，同時(shí)由于其在動(dòng)物體的多種不同組織器官中持續(xù)性表達(dá)，也被認(rèn)為是動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)的一部分，具有重要的生理學(xué)功能。其主要特征是6個(gè)半胱氨酸殘基形成的3對(duì)二硫鍵，成熟肽大約有38-42個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為3-4kDa。根據(jù)空間結(jié)構(gòu)的不同，防御素可以分為3大類:a -防御素、^ -防御素和0 -防御素。禽防御素屬于P -防御素類，3對(duì)二硫鍵分別為Cys-1~Cys-5、Cys-2~Cys_4和Cys_3~Cys_6配對(duì)連接形成，富含精氨酸，具有親水性和親脂性、特征性(6-片層結(jié)構(gòu)。迄今為止，已在雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 14種(6-防御素，這些雞防御素基因被分別命名為AvBDl~14。其中雞P -防御素9 (AvBD9)廣泛分布于雞的各類器官組織中，尤其在粘液囊、食道、嗉囊、肝臟和胃等消化系統(tǒng)各器官組織中表達(dá)量較高。消化道為動(dòng)物機(jī)體與食源性病原接觸部位，也是其侵入部位。AvBD9具有良好的生物安全性，且具有較強(qiáng)的抗菌活性，能夠抑制或者殺死病原菌，這對(duì)雞消化道健康，尤其對(duì)防止上消化道感染等機(jī)體局部防御和炎癥中起著重要作用。在畜禽生產(chǎn)中可用于防治疾病，促進(jìn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖，具有潛在的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值，而分子重組技術(shù)是蛋白類或肽類產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用的有效途徑。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量高、可大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，又具有真核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白翻譯后修飾、加工及折疊的優(yōu)勢(shì)，且外源基因的遺傳穩(wěn)定性較好，是目前廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有很高的生物安全性，獲得包括美國(guó)FDA在內(nèi)的廣泛認(rèn)可。畢赤酵母自身分泌很少量的蛋白，易于異源蛋白的分離純化，且其分泌的蛋白存在翻譯后加工修飾，使之更接近于天然蛋白的構(gòu)象和活性，因此更適合真核生物基因的表達(dá)。又因其表達(dá)水平穩(wěn)定、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)點(diǎn)，而成為目前最受歡迎的異源蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)之一。醇氧化酶AOXl啟動(dòng)子(pAOXl)是P.pastoris表達(dá)中應(yīng)用較多的啟動(dòng)子，其甲醇誘導(dǎo)性很強(qiáng)。但發(fā)酵過(guò)程中需要用有毒揮發(fā)性的甲醇作為誘導(dǎo)劑，需要碳源的轉(zhuǎn)換，因而操作不方便，且外源蛋白的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(pGAP)是P.pastoris的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，已用來(lái)表達(dá)許多異源蛋白，并獲得了與PAOXl相似的產(chǎn)量。此外，GAP啟動(dòng)子有許多優(yōu)勢(shì):重組菌發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)單，安全性高且不需要大量甲醇的儲(chǔ)存與運(yùn)輸，更適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，具有連續(xù)培養(yǎng)的潛能，且降低了目的蛋白的生產(chǎn)成本。酵母單細(xì)胞蛋白作為飼料具有明顯的優(yōu)勢(shì)，如酵母干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量約50 %-60%;酵母菌中含有豐富的酶類，含有(6 -葡聚糖(57.0 %)、甘露聚糖(6.6 %)、糖蛋白(22.0%)和幾丁質(zhì)等活性成分；蛋白質(zhì)中含有動(dòng)物機(jī)體所必須的各種氨基酸，特別是植物飼料中缺乏的賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量較多，生物學(xué)價(jià)值大大優(yōu)于植物蛋白質(zhì)，單細(xì)胞蛋白的消化率高達(dá)85%~90% ;既對(duì)動(dòng)物具有促生長(zhǎng)作用，又可提高機(jī)體免疫，對(duì)動(dòng)物而言，酵母飼料是一種理想的生物活性蛋白質(zhì)飼料。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的AvBD9基因是一種將來(lái)源于雞的禽P -防御素9基因優(yōu)化處理后的基因，其優(yōu)化處理是根據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)性密碼子進(jìn)行，將酵母不常用的密碼子agg、cgt, ggg、ggc、gca等優(yōu)化為偏愛(ài)密碼子aga、ggt、get等,利用DNASTAR軟件分析后得到的，并在其5/端添加Kex2酶切位點(diǎn)編碼序列AAAAGA，經(jīng)過(guò)這一處理，可使目標(biāo)基因在畢赤酵母中更好的進(jìn)行表達(dá)，并分泌出更接近于天然結(jié)構(gòu)的活性成熟肽。本專利技術(shù)旨在公開(kāi)一種在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)雞AvBD9的方法，首次實(shí)現(xiàn)雞AvBD9基因在酵母中持續(xù)性高水平表達(dá)，且組成型表達(dá)，無(wú)需甲醇誘導(dǎo)，并將雞AvBD9表達(dá)產(chǎn)物分泌到發(fā)酵液培養(yǎng)基中，取上清液，進(jìn)行分離純化處理，并開(kāi)發(fā)出一種綠色、安全、高效的新型飼料添加劑。本專利技術(shù)的能夠分泌AvBD9的酵母工程菌是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 采用受體菌GSl 15、組成型表達(dá)載體質(zhì)粒pGHK a ;目的蛋白的41個(gè)氨基酸的基因片段；重組質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，質(zhì)粒pGHK a的EcoR I和Not I位點(diǎn)之間插入雞AvBD9目的基因片段；重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I和Bgl II酶切線性化，去除Amp抗性基因，電轉(zhuǎn)化至高效畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞；利用MD平板初篩和PCR鑒定篩選出陽(yáng)性重組子，并經(jīng)G418抗性篩選高拷貝重組子；在相同的條件下，對(duì)不同拷貝數(shù)的菌株分別進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)外源蛋白，測(cè)定培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度，選擇出高表達(dá)菌株；再利用高表達(dá)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外，離心所得到的上清液中即含有表達(dá)的蛋白產(chǎn)物——AvBD9。AvBD9在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)方法,包括以下步驟:(I)目的基因AvBD9的優(yōu)化設(shè)計(jì)與合成；(2)雙酶切AvBD9基因與載體pGHKa，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母GS115 ；(3)篩選出來(lái)的重組酵母菌，經(jīng)培養(yǎng)，離心所得上清液中即為AvBD9。AvBD9重組工程菌，其保藏號(hào):CGMCC No7832 ;保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)；保藏日期:2013-06-27 ;分類命名:巴斯德畢赤酵母；拉丁名:Pichia pastoris。所述的發(fā)酵培養(yǎng)是挑取重組酵母菌單菌落接種于5mL YH)液體培養(yǎng)基，30°C、200rpm過(guò)夜培養(yǎng)，而后轉(zhuǎn)接于50mL改良MD液體培養(yǎng)基28°C、200rpm培養(yǎng)2天。 所述轉(zhuǎn)化宿主菌之前，先將重組質(zhì)粒用Sac I和Bgl II進(jìn)行酶切線性化，以去除Amp抗性基因，增加安全性。所述目的基因AvBD9的5丨端添加Kex2酶切位點(diǎn)編碼序列AAAAGA。所述雙酶切所用限制性內(nèi)切酶為EcoR I和Not I。本專利技術(shù)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)勢(shì)及有益成果。本專利技術(shù)AvBD9重組工程菌，比之現(xiàn)有技術(shù)，受體菌選用操作簡(jiǎn)便、快捷，穩(wěn)定性好及易于高密度發(fā)酵的畢赤酵母作為基因表達(dá)宿主，不僅避免了原核表達(dá)中融合蛋白所造成的宿主表達(dá)潛能浪費(fèi)和形成包涵體，而且免去移除載體蛋白的繁瑣程序，并且能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾。[0021 ] 本專利技術(shù)所用的表達(dá)載體自身所帶的信號(hào)肽能將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)上清中，易于分離提純，也易于檢測(cè)，而且通過(guò)AvBD本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種優(yōu)化AvBD9基因，其特征在于，其基因序列如序列表所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種優(yōu)化AvBD9基因，其特征在于，其基因序列如序列表所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化AvBD9基因，其特征在于，所述優(yōu)化AvBD9基因是將AvBD9基因中的酵母不常用密碼子替換成其慣用密碼子設(shè)計(jì)基因序列，并將AvBD9基因在基因的5'端添加EcoR I酶切位點(diǎn)和Kex2酶切位點(diǎn)編碼序列AAAAGA，在基因的3'端添加TAA位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)所獲得的，優(yōu)化AvBD9基因的基因全長(zhǎng)為157bp。3.—種雞3 -防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，包括步驟: (1)優(yōu)化AvBD9基因獲得； (2)雙酶切AvBD9基因與載體pGHKa，連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母GS115獲得重組酵母菌株。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞(6-防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，雙酶切AvBD9基因與載體pGHK a使用的限制性內(nèi)切酶為EcoR I和Not I。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞(6-防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒使用Sac I和Bgl II分別酶切出去Amp抗性基因。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞(6-防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方式為電擊...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：祁克宗，涂健，張永正，彭開(kāi)松，周秀紅，汪雪雁，劉紅梅，張明，陳玎玎，付瑞燕，薛秀恒，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：