【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
—種敲除PrcK基因的自殺質(zhì)粒pYTKLKRT及其構(gòu)建方法
本專利技術(shù)涉及一種自殺質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
近年來研究中研究人員發(fā)現(xiàn)在某些G+菌QS體系中的AIP不僅僅是信號分子，它還具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳桿菌的植物乳桿菌素等等。這些抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)的基因簇中除了含有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因外,還有一個輔助蛋白(accessory protein, AP)編碼基因，它們的產(chǎn)物組成了 AMP輸出和處理體系。AMP的結(jié)構(gòu)基因都位于其相應(yīng)的免疫蛋白基因之前，產(chǎn)生的AMP大多數(shù)富含半胱氨酸，具有疏水性，而且，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，AMP的最大生產(chǎn)量與產(chǎn)生菌的非最佳生長條件有關(guān)。根據(jù)AMP的性質(zhì)不同，可將AMP分為兩大類:一類是I型AMPs或硫醚抗生素，它們是一些對熱穩(wěn)定的肽類，在被分泌之前會被進(jìn)行高度的翻譯后修飾，如nisin、枯草菌素；另一類是II型AMPs或熱穩(wěn)定的AMPs，它們具有特征性的雙甘氨酸基序，分泌之前不存在修飾過程，但在分泌后，前體肽的N端會有一個片段被移去，如植物乳桿菌素、乳酸桿菌素P坐寸O副干釀乳桿菌(Lactobacillusparacasei)HDL 7,革蘭氏陽性菌,2003年從齊齊哈爾豐源食品有限公司乳酸酸菜發(fā)酵液中分離獲得。它最大的特點(diǎn)是在其發(fā)酵液中可產(chǎn)生抑制多種G+、G-和釀酒酵母生長的肽類物質(zhì)，分子量在IOkD左右，熱穩(wěn)定，酸性條件下(PH2~6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更為優(yōu)越，因?yàn)閚isin能有效的抑制革蘭氏陽性菌如一些腐敗菌、致病菌和芽孢...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種敲除prcK基因的自殺質(zhì)粒pYTKLKRT，其特征在于敲除prcK基因的自殺質(zhì)粒pYTKLKRT由prcK基因左側(cè)片段prcKL、prcK基因右側(cè)片段prcKR、四環(huán)素抗性基因和質(zhì)粒pUC18構(gòu)成；片段prcKL的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種敲除PrcK基因的自殺質(zhì)粒pYTKLKRT，其特征在于敲除prcK基因的自殺質(zhì)粒PYTKLKRT由prcK基因左側(cè)片段prcKL、prcK基因右側(cè)片段prcKR、四環(huán)素抗性基因和質(zhì)粒PUC18構(gòu)成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ IDNO:2所示。2.上述敲除prcK基因的自殺質(zhì)粒pYTKLKRT的構(gòu)建方法，其特征在于敲除prcK基因的自殺質(zhì)粒pYTKLKRT按以下步驟進(jìn)行構(gòu)建: 一、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增prcK基因左側(cè)片段prcKL，擴(kuò)增片段prcKL的上游引物為prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列為5’-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，擴(kuò)增片段prcKL的下游引物為prcKL-down，prcKL-down的核苷酸序列為 5’-GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR擴(kuò)增片段prcKL 的反應(yīng)體系為 50 μ L由 10 μ L含Mg2+的 5XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUOy L濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 prcKL-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKL_down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴(kuò)增片段prcKL的反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性3min，98°C變性10s、62°C退火15s、72°C延伸1.5min，共30個循環(huán)，再72°C延伸IOmin ； 二、用限制性內(nèi)切酶SacI及Kpn I對質(zhì)粒pUC18和步驟一獲得的片段prcKL分別進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I prcKL雙酶切片段、5 4 1質(zhì)粒？阢18雙酶切片段、2.5“110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，得到質(zhì)粒pUC18_KL ； 三、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增prcK基因右側(cè)片段prcKR，擴(kuò)增片段prcKR的上游引物為prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列為5’-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，擴(kuò)增片段prcKR的下游引物為prcKR-down，prcKR-down的核苷酸序列為 5’-CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’，PCR擴(kuò)增片段prcKR 的反應(yīng)體系為 50 μ L由 10 μ L含Mg2+的 5XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUOy L濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 prcKR-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKR-down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴(kuò)增片段prcKR的反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性3min，98°C變性10s、55°C退火15s、72°C延伸1.5min，共30個循環(huán)，再72°C延伸IOmin ； 四、用限制性內(nèi)切酶PstI及Kpn I對質(zhì)粒pUC18-KL和步驟三獲得的片段prcKR分別進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I prcKR雙酶切片段、5 4 1質(zhì)粒口此18-此雙酶切片段、2.5 4 110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16 °C過夜連接，得到質(zhì)粒pUC18_KLKR ； 五、以pBR322質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因Tet，擴(kuò)增Tet的上游引物為Tet-up, Tet-up 的核苷酸序列為 5’-CCGGGTACCTCTC...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葛菁萍，王洋，由田，平文祥，
申請(專利權(quán))人：黑龍江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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