一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的制備方法技術

本發明專利技術涉及一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的制備方法及產品，屬于生物制品技術領域。本發明專利技術提供了一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：1）PK-15細胞的擴增培養；2）接種病毒培養制備病毒液；3）病毒濃縮、滅活及制成疫苗產品。本發明專利技術通過使用連續灌流式生物反應器進行擴增PCV-2，具有以下優點：操作空間相對較小、工藝操作簡單、勞動力明顯降低、可通過級聯放大進行大規模生產、維持液中血清含量低、生產成本相對較低、產品質量可控性高。最終所得到的豬圓環病毒2型滅活疫苗具有安全性高、免疫效果好，副作用小等優點。

【技術實現步驟摘要】
—種豬圓環病毒2型滅活疫苗的制備方法
本專利技術涉及及產品，屬于生物制品
。
技術介紹
豬圓環病毒(PCV)于1997年首次在加拿大爆發，隨后在全球很多國家相繼報道該病的出現。PCV有PCVl和PCV-2兩種基因型，Tischer等最早在PK-15細胞中發現PCV-1的存在，該基因型病毒的基因組全長1759bp，與PCV-2的核苷酸相似性在70%左右。豬腎上皮細胞PK-15，來源于豬腎，中文名為豬腎上皮細胞，正常的細胞形態為上皮樣，貼壁生長。該細胞對多種病毒比較敏感，如豬圓環病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)等，可應用于豬圓環病毒疫苗、豬細小病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗等的制備。PCVl并不能引起豬只的發病，但PCV-2則是能引發仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(PMWS)，是仔豬的重要傳染病，同時也是育肥豬的皮炎和腎病綜合征(PDNS)的主要誘因。據最新研究報道，PCV-2型還能夠與其他病毒共感染誘發典型的PMWS癥狀，例如:豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒。易感豬群的發病率約為5%~25%，但發病后死淘率高達80%左右，該病給全球養豬業造成了重大經濟損失。目前生產豬圓環病毒2型主要同傳統的大方瓶或轉瓶進行培養的，這種生產工藝技術含量低，操作簡便，便于技術推廣；但勞動力投入高、無法級聯放大、批次差異明顯以及難以標準化質量控制等技術 瓶頸使其無法在短時間內生產出大量的高質量的疫苗產品。另外，PCV-2具有特殊的生物學特性使其在傳統的生產工藝下無法達到較高的病毒滴度，同樣限制了 PCV-2疫苗的大規模生產。生物反應器是20世紀70年代發展起來的一種新型細胞培養技術，由于其可以裝載的載體容量大從而為細胞生長提供更大的貼壁面積，使細胞大規模培養成為了可能。隨著生物反應器技術的不斷成熟，越來越多的病毒疫苗生產開始轉向利用該技術進行連續培養的生產方式。生物反應器具有傳統細胞培養所不具備的多種技術優勢，這種先進的生產工藝可以很好的解決上述傳統細胞培養中的各種技術瓶頸。當前使用的PCV-2疫苗均是用礦物油作為佐劑，但這種佐劑具有副作用大、安全性低等缺點。MontanideTM ISA206是一種新型的佐劑，由于獨特的分子特點使其與水相的混合乳化時避免添加其他乳化劑。另外，該新型佐劑中使用的油分也有所改進，使用了可代謝的礦物油替換了初期的礦物油，可以進一步提高生物安全性。因此，尋找一種更為高效的大規模生產方式制備PCV-2疫苗成為了當前首要的任務。另外，如何提高該疫苗的安全性同樣值得我們去探索和研究。
技術實現思路
為解決現有技術的不足，本專利技術基于生物反應器制備豬圓環病毒2型滅活疫苗的方法，為豬圓環病毒2型提供一種安全連續封閉式的培養方法,與傳統生產工藝相比具有明顯的優勢。，包括以下步驟:I) PK-15細胞的擴增培養將2~3X IO5個/ml的PK-15細胞接入到生物反應器中，加入片狀載體補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養基，攪拌轉速為90轉/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C，進行細胞懸浮培養，24小時后開啟進液泵和出液泵進行流加培養，其中:每接入IL所述PK-15細胞，加入片狀載體250g，補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養基至4~5L ;2)接種病毒的培養及制備病毒液所述PK-15細胞在所述生物反應器培養至72小時后排出細胞生長液，將重量百分含量為1%的血清的維持液接入所述生物反應器內，接入圓環病毒(YZ株)F15代種毒，病毒接種量為400nmL，病毒維持液添加終濃度為2mmol/L的D-氨基葡萄糖，將pH調整為7.4，溫度設定為36.5°C，培養至24小時開始收獲毒液并同時補充新鮮維持液，繼續培養至病毒接種后240小時，其中:所述步驟I)中每接入IL所述PK-15細胞，每天灌注量為15L ；3)病毒濃縮、滅活及制成疫苗產品。優選的，所述生物反應器為續灌注式生物反應器。優選的，在所述步驟I)之前先確定PK-15細胞培養圓環病毒的生物反應器培養條件，其中所述生物反應器為連續灌注式生物反應器。更優選的，所述確定PK-15細胞培養圓環病毒生物反應器培養的條件為:將2~3 X IO5個/ml的PK-15細胞接入到所述生物反應器內，選用片狀載體，攪拌轉速為90轉/分，溶氧為50%，pH為7.2，溫度為37°C，進行細胞懸浮培養，24小時后開始流加灌注培養，至312小時培養結束。 優選的，所述步驟3)包括乳化，乳化后制得PCV-2 (YZ株)水包油包水劑型滅活疫苗。更優選的，所述乳化的方法為:將佐劑與合格的滅活抗原等量混合于乳化缸內，低速攪拌乳化30分鐘。更優選的，取乳化后的試劑5~IOmL,以3000r/min離心15分鐘，如有分層現象，重復乳化。本專利技術還提供給了所述豬圓環2型滅活疫苗的制備方法所制得的疫苗產品。其中，所述的生物反應器可選用NBS公司連續灌注式生物反應器，涉及的載體為片狀載體，片狀載體裝載量為250g，約合50g/L。灌流培養過程中可以保持細胞生長液或病毒維持液體積不變。疫苗制備時所用的佐劑為雙相油乳劑，例如法國賽比克公司的MontanideTM ISA206。本專利技術通過使用連續灌流式生物反應器進行擴增PCV-2，具有以下優點:操作空間相對較小、工藝操作簡單、勞動力明顯降低、可通過級聯放大進行大規模生產、維持液中血清含量低、生產成本相對較低、產品質量可控性高。最終所得到的豬圓環病毒2型滅活疫苗具有安全性高、免疫效果好，副作用小等優點。【附圖說明】圖1為本專利技術中使用的連續灌流式生物反應器示意圖。圖中，I為培養基加流袋，2為生物反應器主體，3為培養物接收裝置。【具體實施方式】以下對本專利技術的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本專利技術，并非用于限定本專利技術的范圍。實施例1本實例說明PK-15細胞培養圓環病毒生物反應器培養條件以及PCV-2增殖條件的確定。(I)將2X IO5個/ml左右的PK-15細胞接入到反應器中，補充含5%牛血清的DMEM培養基至5L，設定攪拌轉速為90轉/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C，進行細胞懸浮培養，24小時后開啟進液泵和出液泵進行流加培養，每天定時取樣檢測葡萄糖的消耗量并記錄堿液(l%NaOH)的消耗量，連續培養至13天，打開罐體，消化細胞并計數。最終確定培養條件為:為90轉/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C。(2)在細胞反應器培養至48小時、72小時和96小時時排出細胞生長液，將含1%血清的維持液接入反應器內，接入已準備好的圓環病毒(YZ株)F15代種毒，接毒量分別為200mL、400mL和600mL，病毒維持液中含D-氨基葡萄糖濃度為2mmol/L，設定反應器攪拌轉速為90轉/分，溶氧50%，PH7.4，溫度36.5°C，培養至24小時開始收獲毒液并同時補充新鮮維持液，繼續培養至240小時，每日取樣檢測葡萄糖含量同時記錄堿液(l%NaOH)的消耗量，從接毒后24小時開始，每天取2個樣分別檢測毒液的TCID50，并取接毒后24-240小時的混合樣檢測TCID5tlt5最終確定培養條件為:在細胞增殖72小時后以總體積的8%的量接種病毒液，D-氨基葡萄糖的終濃度為2mmol/L，反應器參數設置為90轉/分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：1）PK?15細胞的擴增培養將2～3×105個/ml的PK?15細胞接入到生物反應器中，加入片狀載體，補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養基，攪拌轉速為90轉/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37℃，進行細胞懸浮培養，24小時后開啟進液泵和出液泵進行流加培養，其中：每接入1L所述PK?15細胞，加入片狀載體250g，補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養基至4～5L；2）接種病毒的培養及制備病毒液所述PK?15細胞在所述生物反應器培養至72小時后排出細胞生長液，將重量百分含量為1%的血清的維持液接入所述生物反應器內，接入圓環病毒(YZ株)F15代種毒，病毒接種量為400nmL，病毒維持液添加終濃度為2mmol/L的D?氨基葡萄糖，將pH調整為7.4，溫度設定為36.5℃，培養至24小時開始收獲毒液并同時補充新鮮維持液，繼續培養至病毒接種后240小時，其中：所述步驟1）中每接入1L所述PK?15細胞，每天灌注量為15L；3）病毒濃縮、滅活及制成疫苗產品。

【技術特征摘要】
1.一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟: 1)PK-15細胞的擴增培養 將2~3X IO5個/ml的PK-15細胞接入到生物反應器中，加入片狀載體，補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養基，攪拌轉速為90轉/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C，進行細胞懸浮培養，24小時后開啟進液泵和出液泵進行流加培養，其中:每接入IL所述PK-15細胞，加入片狀載體250g，補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養基至4~5L ; 2)接種病毒的培養及制備病毒液 所述PK-15細胞在所述生物反應器培養至72小時后排出細胞生長液，將重量百分含量為1%的血清的維持液接入所述生物反應器內，接入圓環病毒(YZ株)F15代種毒，病毒接種量為400nmL，病毒維持液添加終濃度為2mmol/L的D-氨基葡萄糖，將pH調整為7.4，溫度設定為36.5°C，培養至24小時開始收獲毒液并同時補充新鮮維持液，繼續培養至病毒接種后240小時，其中:所述步驟I)中每接入IL所述PK-15細胞，每天灌注量為15...

【專利技術屬性】
技術研發人員：范娟，李群，劉俊斌，錢鐘，宋慶慶，
申請(專利權)人：揚州優邦生物制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：