使用植物細胞高效地生產志賀毒素蛋白質等的細菌毒素蛋白質。志賀毒素蛋白質等細菌毒素蛋白質是這樣生產的：用含有下述DNA的DNA構建物轉染植物細胞，使植物細胞生產上述細菌毒素蛋白質，所述DNA是編碼介由具有以下特征（A）和（B）的肽而串聯連接的雜化蛋白質的DNA，（A）氨基酸的個數為12～30個；（B）脯氨酸的含有率為20～35％。
【技術實現步驟摘要】
細菌毒素疫苗本申請是基于以下中國專利申請的分案申請:原案申請日:2009年4月28日原案申請號:CN200980116606.9 (PCT/JP2009/058345)原案申請名稱:細菌毒素疫苗
本專利技術涉及用于應對由志賀毒素、霍亂毒素、大腸桿菌易熱性毒素等細菌毒素引起的疾病的疫苗的雜化蛋白質以及用于生產該雜化蛋白質的DNA構建物。
技術介紹
志賀毒素(Stx、~口毒素)是病原性大腸桿菌中腸管出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli)產生的蛋白質性外毒素。志賀毒素引起出血性腸炎、溶血性尿毒癥癥候群、腦病等。志賀毒素大致分為Stxl和Stx2，分別還可以再分成小類。Stx2可以例舉引起豬水腫病的Stx2e。已知豬水腫病高發于斷奶后I~2周的幼豬。水腫病菌的感染導致的致死率高達50~90%。此外,霍亂毒素(CT)是霍亂桿菌(Vibrio cholerae)產生的蛋白質性外毒素。已知CT引起劇烈的腹瀉和嘔吐。·此外，大腸桿菌易熱性毒素(LT)是毒素原性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichia coli)產生的蛋白質性內毒素。已知LT引起腹灣和嘔吐。已知Stx、LT、CT中任何一種細菌毒素均是由與細胞附著有關的B亞單位5倍體和具有毒性的A亞單位I倍體構成。此外，已知LT和CT在結構上和功能上都很類似。作為由這些細菌毒素引起的疾病的預防方法，已知的有通過注射或經鼻噴霧的方式給予疫苗或者口服疫苗的方法。例如，已知有用重組大腸桿菌生產無毒化的Stx2e蛋白質、通過注射投予給豬的技術(非專利文獻I)。但是，存在以下問題:利用重組大腸桿菌的無毒化Stx2e蛋白質的產量不夠；通過注射投予疫苗需要花費人力等。此外，從減輕勞動力的觀點，口服投予疫苗的方法在畜產領域受到高度專注。在這樣的背景下，開發了使用轉基因技術使植物產生細菌毒素蛋白質的技術。例如，記載了含有編碼LT蛋白質的B亞單位(LTB)的DNA、表達該DNA的轉基因植物(專利文獻1、專利文獻2)。此外，還記載了表達編碼LT蛋白質或CT蛋白質的DNA的轉基因植物(專利文獻3)。但是，這些技術存在蛋白質的產量不足的問題。此外，報告了讓萵苣生產LTB的例子(非專利文獻2)。在該研究中，使用植物高表達啟動子一花椰菜花葉病毒(力U 7 9 7 — --Μ夕々^ ^ ^ ) 35S RNA啟動子(CaMV35S)和增強子一Kozak序列，在萵苣內表達改變了密碼子的LT蛋白質的B亞單位的基因。結果，報告LT蛋白質的B亞單位蓄積了萵苣的總可溶性蛋白質的約2.0質量％。但是，以這種程度的蛋白質的蓄積量，對于利用轉基因植物有效地防除細菌病還是不夠。即，有必要使目的細菌毒素蛋白質在植物細胞內有效地生產、蓄積。專利技術人發現:通過用來自植物的醇脫氫酶基因的5'-非翻譯區(ADH5’UTR)來表達來自植物的分泌信號肽加成在氨基末端的Stx2e蛋白質，可以使萵苣等植物有效地生產Stx2e蛋白質、在植物體內高濃度蓄積,并申請了專利(專利文獻4)。 【專利文獻I】日本專利特表平10-507916號公報【專利文獻2】日本專利特開2000-166411號公報【專利文獻3】日本專利特表2002-533068號公報【專利文獻4】國際公開第2009/ 004842號小冊子【非專利文獻I】Makino 等,Microbial Pathogenesis, 31 卷,N0.1, 2001 年 7月,pp.1-8(08)【非專利文獻2】Kim 等，Protein Expression and Purification, 51卷，N0.1, 2006 年 I 月，pp.22-27 (06)
技術實現思路
本專利技術的課題是，用植物細胞來更有效地生產Stx蛋白質以及具有與Stx蛋白質類似的高次結構的其他細菌毒素蛋白質。專利技術人使植物細胞生產雜化蛋白質，所述雜化蛋白質是2或3個Stx2e、CT等細菌毒素的蛋白質介由特定序列的肽串聯連接的雜化蛋白質，結果成功地做到細菌毒素的蛋白質在植物細胞內高濃度蓄積，并完成了本專利技術。SP，本專利技術如下所述。(I) 一種雜化蛋白質，是2或3個志賀毒素蛋白質、霍亂毒素蛋白質或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質分別介由具有以下特征(A)和(B)的肽而串聯連接的雜化蛋白質，(A)氨基酸的個數為12~30個；(B)脯氨酸的含有率為20~35%。(2)如(I)記載的雜化蛋白質，上述肽還具有以下特征(C)，(C)脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置。(3)如(2)記載的雜化蛋白質，上述肽含有序列號2、82或84所示的氨基酸序列。(4)如(3)記載的雜化蛋白質，2個志賀毒素蛋白質、霍亂毒素蛋白質或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質介由含有序列號2所示的氨基酸序列的肽串聯連接。(5)如(I)~(4)任意一項記載的雜化蛋白質，志賀毒素蛋白質是志賀毒素蛋白質的B亞單位。(6)如(I)~(5)任意一項記載的雜化蛋白質，志賀毒素蛋白質是Stx2e蛋白質。(7)如(I)~(4)任意一項記載的雜化蛋白質，霍亂毒素蛋白質是霍亂毒素蛋白質的B亞單位。(8)如(4)記載的雜化蛋白質，具有序列號10、12、14或16所示的氨基酸序列。(9)如(3)記載的雜化蛋白質，具有序列號86、88、90、92、94、96、98或100所示的氨基酸序列。(10)如(I)~(9)任意一項記載的雜化蛋白質，來自植物的分泌信號肽加成在氨基末端。(11)如(10)記載的雜化蛋白質，內質網殘留信號肽加成在羧基末端。(12) (I)~(9)任意一項記載的雜化蛋白質，葉綠體轉移信號肽加成在氨基末端。(13)—種DNA構建物，含有編碼(I)~(12)任意一項記載的雜化蛋白質的DNA。(14)如(13)記載的DNA構建物，含有具有序列號9、11、13或15所示的堿基序列的 DNA。(15)如(13)記載的DNA構建物，含有具有序列號85、87、89、91、93、95、97或99所不的喊基序列的DNA。(16)如(13)~(15)任意一項記載的DNA構建物，編碼雜化蛋白質的DNA在來自植物的醇脫氫酶基因的5’ -非翻譯區可表達地連接。(17)如(16)記載的DNA構建物，上述來自植物的醇脫氫酶基因的5’ -非翻譯區來自煙草。(18)如(17)記載的DNA構建物，具有序列號24~29任意一項所示的堿基序列。(19)如(17)記載的DNA構建物，具有序列號101~111任意一項所示的堿基序列。(20)—種重組載體，含有(13)~(19)任意一項記載的DNA構建物。(21) —種轉染子(形質轉換體，transfectant)，被(20)記載的重組載體轉染。(22)如(21)記載的轉染子，轉染子是轉染植物細胞或轉染植物。(23)由(21)或(22)記載的轉染子得到的種子。(24)由序列號2、82或84所示的氨基酸序列構成的肽。【附圖說明】【圖1】表示Stx2eB表達載體的圖案的圖。圖中，一表示翻譯開始點、▽表示翻譯后被切斷的部位。【圖2】在使用了萵苣原生質體的一時性表達實驗中得到的、表示Stx2eB的蓄積水平的照片。【圖3】在使用了萵苣原生質體的一時性表達實驗中得到的、表示CTB的蓄積水平的照片。【圖4】表示本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種雜化蛋白質，是2或3個志賀毒素蛋白質Stx2e蛋白質的B亞單位、霍亂毒素蛋白質的B亞單位或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質的B亞單位分別介由具有以下特征（A）、（B）、（C）和（D）的肽而串聯連接的雜化蛋白質，（A）氨基酸的個數為12～30個；（B）脯氨酸的含有率為20～35％；（C）脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置；（D）脯氨酸以外的氨基酸中，絲氨酸以及甘氨酸的合計含有率為70%以上。
【技術特征摘要】
2008.05.02 JP 2008-1205731.一種雜化蛋白質，是2或3個志賀毒素蛋白質Stx2e蛋白質的B亞單位、霍亂毒素蛋白質的B亞單位或大腸桿菌易熱性毒素蛋白質的B亞單位分別介由具有以下特征(A)、(B)、(C)和(D)的肽而串聯連接的雜化蛋白質， (A)氨基酸的個數為12~30個； (B)脯氨酸的含有率為20~35%； (C)脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置； (D)脯氨酸以外的氨基酸中，絲氨酸以及甘氨酸的合計含有率為70%以上。2.如權利要求1記載的雜化蛋白質，其中，所述肽的(A)氨基酸的個數為12~22。3.如權利要求1記載的雜化...
【專利技術屬性】
技術研發人員：澤田和敏，吉田和哉，松井健史，
申請(專利權)人：出光興產株式會社，國立大學法人奈良先端科學技術大學院大學，
類型：發明
國別省市：
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