本發明專利技術公開3個多頭絨泡菌14-3-3蛋白（P14-3-3）的單克隆抗體mAbα+、mAbβ+和mAbγ+，表達分泌上述三個單克隆抗體的雜交瘤細胞株McAbα+、McAbβ+或McAbγ+的微生物保藏號分別是：CCTCC?NO:C2012131、C2012132、C2012133，保藏地點：中國典型培養物保藏中心，其目的是提供研究14-3-3蛋白結構與功能以及P14-3-3隨細胞周期和生命周期表達變化的有效手段。本發明專利技術所制備的抗體效價均高于100K，親和常數均都大于2.12×108，能夠用于研究低等真核生物14-3-3蛋白的結構與功能以及14-3-3蛋白隨細胞周期和生命周期的表達變化規律，具有很好的商業用途。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于免疫學領域，特別是涉及分泌抗14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其分泌的14-3-3蛋白單克隆抗體和應用。
技術介紹
14-3-3蛋白(14-3-3S)是真核生物普遍存在的分子伴侶蛋白，但目前尚未在原核生物中發現該類蛋白[1]。已有的報道顯示，脊椎動物存在由7種基因編碼的9種14-3-3S亞型(α、β、gamma、δ、ε、η、ξ、σ和τ )，其中α和σ分別是β和ξ的磷酸化形式[1]。擬南芥有13種14-3-3亞型,被劃分為ε ( μ、ε、J1、ι和ο )和非ε ( κ、λ、ψ、ν、υ、ω、φ和 X )兩個家族[2],大豆有 18 個 14_3_3s 亞型(a、b、C、d、e、f、g、h、1、j、k、1、m、n、o、p、q和r),是目前發現的最大14_3_3家族[3]。酵母含有2個14_3_3亞型Bmhl和Bmh2，編碼這兩個蛋白的基因分別稱作rad24和rad25[4]。在白色念珠菌[5]和阿米巴蟲[6]各發現I個14-3-3蛋白基因。P14-3-3是專利技術人在多頭絨泡菌發現的14_3_3蛋白[7]。14-3-3蛋白單體是由9個反平行的α螺旋構成的杯狀結構，杯狀結構的底部是由3個反向平行的α螺旋通過疏水作用重疊構成的，杯狀體底部的其余部分和側面由另外6個反向平行的α螺旋構成[8，9]。有報道顯示，14-3-3蛋白N-端和C-端的非保守序列是影響14_3_3s的功能差異的決定因素,其中N-端的差異決定了 14_3_3s各亞型形成同源或異源二聚體的傾向；而0端的序列差異決定了 14-3-3S功能的特異性[2’1(U1]。天然14-3-3蛋白主要以同源或異源二聚體形式存在，14-3-3 二聚體界面由一個單體的螺旋I與另一單體的螺旋3和4構成的 ，界面內包埋著幾個疏水殘基和極性殘基，外周則由螺旋2形成的鹽橋連接，螺旋5-9形成二聚體的外側和底部。研究表明，14-3-3蛋白可以同時與兩個靶蛋白或一個靶蛋白的兩個結構域相互作用，并調節靶蛋白的生物活性[12]。磷酸化是影響靶蛋白與14-3-3S相互作用的關鍵因素[13]，14-3-3S結合的磷酸化靶蛋白基序通常有4種模式:RSXpSXP、RXF/YpSXP[14]、YpTV[15]和RXSX-pSXP (其中，pS代表磷酸化絲氨酸，PT代表磷酸化蘇氨酸)[16]。已有的報道顯示，14-3-3s作用的配體蛋白有300余種[17]。14-3-3s主要通過配體蛋白(如激酶、受體蛋白、酶類、結構和細胞骨架蛋白、腳手架分子、細胞周期調控的蛋白、基因轉錄調控蛋白和細胞凋亡蛋白等)參與細胞的生長、分化、存活、凋亡、遷移和擴展、信號傳導、蛋白跨膜轉運、脅迫響應、周期調控、基因復制和轉錄調控等生命過程[18，19]。因此，14-3-3蛋白是研究各種生命活動的重要切入點之一，特異性的14-3-3蛋白抗體是研究14-3-3s在各種生命活動中作用的重要手段之一。專利技術人在前期研究中發現，P14-3-3能激活Gal4蛋白調控的Y187酵母報告基因表達；P14_3_3 蛋白的二聚體結合結構域(dimer-binding motif2, DBM2)上的 Ser62 和 Ser67以及C端235ThrSer236是影響P14-3-3轉錄激活功能的關鍵磷酸化位點m。以P14-3-3為餌蛋白，通過酵母雙雜交篩選多頭絨泡菌cDNA文庫，獲得近200個P14-3-3相關蛋白基因，這些基因編碼的蛋白包括激酶、代謝酶類、轉錄因子、轉錄調控蛋白、離子通道蛋白、結構蛋白、細胞骨架蛋白、受體蛋白、抗病相關蛋白、細胞周期調控蛋白及細胞凋亡蛋白。專利技術人還發現P14-3-3與PSR (多頭絨泡菌RNA選擇性剪接調控蛋白)、PSm-E和PSm_D3 (PSm-E和PSm-D3為多頭絨泡菌pre-mRNA剪接復合物U snRNP核心蛋白Sm的E和D3亞基)在哺乳動物細胞質都能相互作用，并確定了相互作用關鍵氨基酸和肽段，說明了 P14-3-3參與基因的轉錄后加工。此外，專利技術人還發現，P14-3-3不但能提高Hela細胞的增殖能力，還能縮短Hela細胞的Gl期、延長G2期；此外，表達P14-3-3的Hela細胞的Bcl_2蛋白水平出現明顯上調，抗凋亡誘導劑TNF α和CHX脅迫的能力明顯增強，說明Ρ14-3-3可通過調控抗凋亡蛋白表達參與細胞的凋亡過程。上述結果說明，Ρ14-3-3不僅在基因轉錄激活和轉錄后加工中扮演重要角色，還具有促進細胞增殖，提高細胞抗凋亡能力的作用[2°]。因此有必要制備Ρ14-3-3的單克隆抗體，以便開展Ρ14-3-3的生理功能研究。哺乳動物有7個14-3-3蛋白亞型，亞型之間的序列比較保守。目前，文獻報道的和市售的14-3-3蛋白抗體主要以哺乳動物14-3-3蛋白抗體為主，而且以多克隆抗體為主。Abcam公司銷售的14-3-3 ξ抗體是以14_3_3 ξ的N端重組片段以及C端合成多肽為抗原免疫動物制得的。santa cruz公司銷售的14_3_3 ξ抗體是以14_3_3 ξ C端的16個氨基酸為抗原制備的。國內關于14-3-3蛋白抗體制備不多見，都是以14-3-3重組蛋白作為抗原免疫動物，獲得相關的抗體。在國內市場上，僅有杭州宜康生物技術有限公司生產出售商品化的14-3-3 β抗體。董長松[21]等制備了 14-3-3 ζ的單克隆抗體。錢春艷[22]等制備了日本血吸蟲重組信號蛋白14-3-3的單克隆抗體，并發現其與華支睪吸蟲、大腸埃希菌可溶性抗原無明顯交叉反應。目前為止，尚未看到14-3-3蛋白Ρ14-3-3單克隆抗體和酵母14_3_3蛋白Bmhl和Bmh2單克隆抗體的相關報道。基于上述理由，目前需要制備至少能分泌抗14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株以及至少能識別多頭絨泡菌14-3-3蛋白的單克隆抗體，尤其是制備具有抗體效價高、親和常數大、滴度高、特異性好的單抗及其雜交瘤，并將其應用于免疫印跡和免疫共沉淀等實驗，以及分離14-3-3蛋白及其配體蛋白。
技術實現思路
本專利技術第一個目的是提供分泌14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于:該組雜交瘤細胞株McAb α +、McAb β +或McAb Y +,其微生物保藏號分別是:CCTCCNO:C2012131、CCTCC N0:C2012132、CCTCC NO:C2012133，保藏地點:中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2013年3月8日。在一個實施方案中，該組雜交瘤細胞株是由表達抗體mAb a +、mAb β +和mAb Y +的BALB/c鼠B淋巴細胞與NS-1骨髓瘤細胞融合后，經HAT培養液篩選和亞克隆制備而成的。本專利技術第二個目的是提供由上述雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體。在一個實施方案中，所述單克隆抗體是mAb a +、mAb β +和mAb Y +。在另一個實施方案中，所述單克隆抗體分別特異識別14-3-3蛋白上的抗原決定簇肽段 l-MTHDESREDS-10、18-EQAERYDEMV-27 和 245-PKPVEDEAPA-255。在一個具體實施方案中，抗體mAb α +所識別的抗原決定簇肽段為MTHDESREDS ；抗體mAb β +所識別的抗原決定簇肽段為EQA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一組分泌14?3?3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于：該組雜交瘤細胞株McAbα+、McAbβ+或McAbγ+，其微生物保藏號分別是：CCTCC?NO:C2012131、C2012132、C2012133，保藏地點：中國典型培養物保藏中心。
【技術特征摘要】
1.一組分泌14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于:該組雜交瘤細胞株 McAb a +、McAb β + 或 McAb Y +，其微生物保藏號分別是:CCTCC NO: C2012131、C2012132、C2012133，保藏地點:中國典型培養物保藏中心。2.權利要求1的雜交瘤細胞株,其中該組雜交瘤細胞株是由表達抗體mAba+、mAb3+和mAb Y +的BALB/c鼠B淋巴細胞與NS-1骨髓瘤細胞融合后，經HAT培養液篩選和亞克隆制備而成的。3.由權利要求1或2的雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體。4.權利要求3所述的單克隆抗體,其中所述單克隆抗體是mAba +、mAb β +和mAb Y +,其中，抗體mAb a +所識別的抗原決定簇肽段為MTHDESREDS ;抗體mAb β +所識別的抗原決定簇肽段為EQAERYDEMV ;抗體mAb Y +所識別的抗原決定簇肽段為PKPVEDEAPA。5.權利要求4中的抗體，其中: ①mAba +、rnAb β +和mAb Y +的亞型均為IgG2b，效價為128000，且其與P14-3-3蛋白反應的親和常數分別為:2.72X 108、4.26 X IO9和2.52 X IO8 ； ②mA...
【專利技術屬性】
技術研發人員：邢苗，劉士德，張建華，陳乃權，羅慧琳，
申請(專利權)人：深圳大學，深圳伯美生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
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