一種人類及哺乳動物細胞表達載體及其應用制造技術

本發明專利技術提供了一種人類及哺乳動物細胞表達載體及其應用，所述表達載體的核苷酸序列如Seq?ID?No.1或Seq?ID?No.2所示，其是以pCAT3-control作為出發載體構建的一種表達載體，本發明專利技術的表達載體能夠顯著提高所攜帶目的基因的表達水平，同等條件下，比含MAR且不含EGFP的表達載體可顯著提高目的基因的表達。

【技術實現步驟摘要】
一種人類及晡乳動物細胞表達載體及其應用
本專利技術屬于基因工程
，具體地說，涉及一種人類及哺乳動物細胞表達載體及其應用。
技術介紹
基因工程(gene engineering),也稱重組DNA技術,是根據科研或生產需要,在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(DNA片段)，在體外切割，拼接形成重組DNA，然后將重組DNA與載體重新組合，再將其引入到不含該DNA的受體細胞中，進行復制和表達，生產出符合人類需要的產品或創造出生物的新性狀，并使之穩定地遺傳給下一代。按照目的基因的克隆和表達系統，分為原核生物基因工程、植物基因工程、動物基因工程和酵母基因工程。基因工程為工農業生產和醫藥衛生事業開辟了新的應用途徑，也為遺傳病的診斷和治療提供了有效方法，具有廣泛的應用價值。此外，基因工程還可應用于基因的結構、功能與作用機制的研究，有助于對生命起源和生物進化等重大問題的探討。目前，隨著轉基因技術的廣泛應用，轉基因沉默(Transgene silencing)和基因表達水平低下已成為轉基因動植物急需解決的關鍵問題。研究發現通過Southern blot、RT-PCR等證實轉基因已整合到宿主的基因組中，且保留完整的拷貝，但是卻不能穩定表達或表達水平低下，有時甚至完全被抑制。這種外源基因在宿主細胞中表達受到抑制的現象稱之為轉基因沉默。為了獲得穩定表達的轉基因株，研究人員在克服轉基因沉默方面進行了許多有益的嘗試，比如在構建表達載體時選用強啟動子、使用增強子、在轉基因操作時進行去甲基化處理等。而利用核基質結合區(matrix attachment region, MAR)來提高轉基因表達是近年來發展起來的克服外源基因沉默的一種有效方法。MAR序列，亦稱核骨架結合區(scaffold attachment region, SAR)序列，是真核生物細胞內染色質上可與細胞核基質結合的一段特殊DNA序列，主要特征是富含AT堿基對，位于基因兩側的非編碼區。作為真核生物的一種新的順式作用元件，目前關于MAR能提高外源基因表達水平，降低轉基因沉默的報道已有很多(Buceta M, GalbeteJL, KosticC，et al.Use of human MAR elements to improve retroviral vector production[J].Gene Ther,2011, 18(1):7-13.Ley D, Harraghy N, Le Fourn V, et al.MAR elementsand transposons for improved transgene integration and expression[J].PLoSOne,2013, 8 (4):e62784.Harraghy N, Regamey A,Girod PA,et al.1dentification ofa potent MAR element from the mouse genome and assessment of its activityin stable and transient transfections[J].J BiotechnoI, 2011,154 (I): 11-20.Harraghy N, Buceta M, Regamey A, et al.Using matrix attachment regions to improverecombinant protein production [J].Methods Mol Biol, 2012，801:93_110)。然而，MAR在提高轉基因表達水平方面仍不理想。因此，亟待開發出一種提高外源基因在人類及哺乳動物細胞表達水平的方法或產品。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種新型的人類及哺乳動物細胞表達載體及其應用。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種人類及哺乳動物細胞表達載體，其核苷酸序列如 Seq ID N0.1 或 Seq ID N0.2 所示。所述表達載體是以pCAT3-control為骨架載體，含有β -珠蛋白MAR序列及EGFP序列。在SV40啟動子的上游插入β -珠蛋白MAR序列；在MAR序列與SV40啟動子序列之間插入一段不同長度的EGFP序列片段，所插入的DNA片段大小分別為350、750bp。所述β -珠蛋白MAR序列GenBank登錄號為L22754.1 ；EGFP序列GenBank登錄號為 U55763.1。所述表達載體可按照基因工程領域的常規方法構建。本專利技術還提供所述人類及哺乳動物細胞表達載體在高效表達外源基因中的應用。即，將外源基因插入到所述表達載體的SV40啟動子下游，然后將攜帶有所述外源基因的重組載體轉化人類或哺乳動物細胞中，隨宿主細胞高效表達。本專利技術提供的一種人類及哺乳動物細胞表達載體，其是以pCAT3-C0ntr0l作為出發載體構建的一種表達載體，本專利技術的表達載體能夠顯著提高所攜帶目的基因的表達水平，同等條件下，比含MAR且不含EGFP的表達載體可顯著提高目的基因的表達。【附圖說明】圖1是pCAT3_control載體的質粒圖譜。圖2是表達載體pCATG的質粒圖譜。圖3是表達載體pCAD的質粒圖譜。圖4A和圖4B分別是表達載體pCACl、pCAC2的質粒圖譜。圖5是表達載體pCAD-VEGF的質粒圖譜。圖6A和圖6B分別是表達載體pCACl-VEGF、pCAC2_VEGF的質粒圖譜。圖7是實施例3中各實驗組及空白對照組的VEGF蛋白表達水平的比值柱形圖；其中，1:轉化MAR與轉基因之間含有750bp的DNA片段的表達載體VEGF表達量；2:轉化MAR與轉基因之間含有350bp的DNA片段的表達載體VEGF表達量；3:轉化含MAR序列的表達載體VEGF表達量；4:轉化不含MAR序列表達載體VEGF表達量；5:未轉化質粒的CHO細胞VEGF表達量。圖8是實施例3中各實驗組及對照組的Western Blot分析結果；其中，1:轉化不含MAR序列表達載體；2:轉化含MAR序列的表達載體；3:轉化MAR與轉基因之間含有350bp的DNA片段的表達載體；4:轉化MAR與轉基因之間含有750bp的DNA片段的表達載體。【具體實施方式】以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。以下實施例中使用的大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109、pCAT-3-control 質粒載體、細胞系、質粒載體和試劑、工具酶均為市售商品。pCAT-3-control質粒載體購自Promega生物公司(圖1)。實施例1表達載體pCAD的構建1.1含neomycin真核抗性基因選擇復合體的表達載體pCATG的構建1.1.1PCR擴增neomycin真核抗性基因選擇復合體根據neomycin真核抗性基因選擇復合體序列(GenBank登錄號為EF437957.1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人類及哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1或Seq?ID?No.2所示。

【技術特征摘要】
1.一種人類及哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID N0.1或Seq ID N0.2 所示。2.權利要求1所述表達載體在高效表達外源基因中的應用。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張俊河，王天云，董衛華，王芳，趙春澎，柴樹潔，王小引，王俐，楊瑞，李琴，
申請(專利權)人：新鄉醫學院，
類型：發明
國別省市：