用于一次性生物技術方法的改良深層濾器技術

一種初步澄清進料的方法，所述方法包括化學處理的絮凝的進料，包含所關注的靶生物分子如mAb、哺乳動物細胞培養(yǎng)物或細菌細胞培養(yǎng)物，使用初步澄清深層過濾裝置但不使用初步澄清過濾步驟或初步澄清切向流微濾步驟。所述初步澄清深層過濾裝置包含多孔深層濾器，具有不同孔評級的分級多孔層。所述初步澄清深層過濾裝置以約10升/m2/hr-約100升/m2/hr的流速過濾液體進料，包括化學處理的絮凝的進料，其包含絮凝的細胞碎片和膠體顆粒，具有約0.5pm-200pm的粒徑分布。還提供使用和制備所述初步澄清深層過濾裝置的試劑盒和方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于一次性生物技術方法的改良深層濾器相關申請的交叉引用本申請要求于2011年7月8日提交的美國臨時專利申請第61/571,994號的權益，其全部內容援引加入本文。
一般來說，本專利技術涉及進料的初步澄清。在某些具體實施方案中，本專利技術提供進料、進料流、原料、細胞培養(yǎng)液等的初步澄清深層過濾方法，其利用初步澄清深層過濾裝置但不使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微濾步驟。在其他實施方案中，本專利技術提供化學處理的進料的初步澄清深層過濾方法，其中細胞團已絮凝為較大的聚集體。
技術介紹
制備包括蛋白如單克隆抗體(mAb)在內的藥物級別的生物分子是一個復雜的制備過程，包括設計用來制備用于患者的高質量產品的多種過濾、離心和色譜技術。細胞培養(yǎng)收獲物和高固體原料的澄清可以是艱巨的任務，這是由于來自現代化生產批量生物反應器的大體積收獲物(≤25,000L)和高細胞密度通常在隨后的色譜操作之前需要初步以及二次澄清。因此，細胞收獲物和高固體原料如哺乳動物細胞和mAb的制備過程的收獲和澄清是過去20年左右進行的許多演變和評價的產物。現在通常期望哺乳動物細胞培養(yǎng)物和mAb的收獲技術以高收率(>95％)和最小細胞破裂的方式操作。隨著產物分子滴度增加，較高的細胞團和較大量的產物對下游純化步驟提出挑戰(zhàn)。較高的細胞密度在澄清和無菌過濾期間造成困難。較高的產物濃度一般導致增加的雜質負荷且需要較大的色譜安裝。因此，提高效率和通量形式的改良大受歡迎。漸增的治療性mAb需求使得人們致力于增加工業(yè)治療性單克隆抗體生產的產品生產、質量、加工效率和成本效益。過去十年見證了生產、上游細胞培養(yǎng)產物滴度的大幅增長以及表征雜質和污染物的技術進步。進料、進料流、原料、細胞培養(yǎng)液等(包括高固體進料，例如包含mAb和哺乳動物細胞培養(yǎng)原料的高固體進料)的初步澄清去除大量生物質，特別是全細胞和其他較大的細胞碎片，然后二次澄清，去除較小的膠體顆粒以及損害下游濾器容量的其他顆粒。在mAb和哺乳動物細胞培養(yǎng)液和原料的生產過程中，離心通常是初步澄清步驟。mAb生產商投入了大量時間和精力增加原料的產品滴度。然而，雖然較高滴度增加細胞培養(yǎng)生產率，但是其還產生具有較大量生物質和細胞碎片含量的原料。包含這樣較大量生物質和細胞碎片的進料可以在離心后產生高濁度離心液(centrate)。高濁度離心液常減少離心下游使用的二次澄清深層濾器和隨后的無菌濾器的產量。減少的產量引起一系列問題，從增加的加工成本到加工過程的偏差，這是由于濾器的堵塞和長期加工延遲。最后，使用離心初步澄清在運行之間需要廣泛的經過驗證的清潔程序以試圖減少批次和治療性分子物質之間交叉污染的風險。在期望于相對短的時間內加工多種產物的試驗或臨床規(guī)模的生物治療性生產中，這特別有問題。離心清潔程序減慢試驗工廠轉換至生產不同生物分子的能力，并且大大增加生產運行之間交叉污染的風險。此外，在初步澄清步驟中，離心不可以有效地從這些原料去除所有顆粒和細胞碎片，因此在離心步驟之后，隨后的色譜步驟之前需要利用深層過濾的二次澄清步驟?；蛘?，已證實連續(xù)過濾運行可用于從原料去除不同大小的細胞和細胞碎片，但是通常體積通量限制應用于較小體積(<1000L)，其中濾器安裝具有合理的大小。過濾的使用大大減少交叉污染的風險，并且在運行之間無需清潔和清潔驗證，這是由于過濾裝置的一次性性質。不幸的是，低通量要求大量的濾器單元，這可以減少過濾收率，因為每個連續(xù)步驟導致通過濾器裝置和設備的滯留體積損失一部分的進料溶液。為了進一步提高澄清性能、通量和下游過濾操作，已使用細胞培養(yǎng)收獲物的絮凝。絮凝劑是這樣的一類物質，其可以從溶液聚集和凝集細顆粒，導致它們從液相沉降且溶液濁度減少。絮凝可以以各種方式完成，包括聚合物處理、化學處理(pH改變)或添加表面活性劑。使用絮凝劑沉淀可以用來選擇性地去除雜質，同時將蛋白產物留在溶液中。但是，絮凝劑尚未廣泛用于mAb、哺乳動物細胞和所關注的原料的其他生物分子細胞材料的澄清。通過化學品絮凝細胞培養(yǎng)收獲物需要使用酸如乙酸，或者聚合物如殼聚糖、多糖、多胺或聚丙烯酰胺。絮凝已用作可選分離技術以增加離心澄清通量和離心液質量，從而改善下游過濾操作。雖然化學絮凝在團聚細胞碎片和細胞污染物(宿主細胞蛋白和DNA)中非常有效，但是所得的絮凝懸浮液一般不易于在過濾之前不使用離心而通過普通過濾方法分離。絮凝劑沉淀細胞、細胞碎片和蛋白，這是因為蛋白上的電荷與聚合物(例如聚電解質)上的電荷的相互作用，產生不溶性復合物，并且隨后通過剩余電荷相互作用或通過復合物上的疏水斑塊橋接不溶性復合物以形成較大的簇集。為了去除這些大簇集，離心步驟或切向流微濾是澄清的主要模式，然后進行二次澄清步驟，其中深層過濾廣泛用于在捕獲色譜步驟之前澄清細胞培養(yǎng)液。因為離心不可以遞送不含顆粒的離心液，下游需要進一步安裝深層濾器(二次深層過濾)和無菌濾器。切向流微濾(也稱為交叉流微濾)與離心競爭從哺乳動物細胞培養(yǎng)物收獲和澄清mAb和治療性產物。這種技術提供的一個優(yōu)點是產生不含顆粒的收獲液，需要極少的額外過濾。但是，用于細胞培養(yǎng)收獲物的切向流微濾膜常受到膜污染問題(無法挽回的膜通量下降)的困擾，并且通常每次使用之后對膜需要按照完全清潔方案的嚴格復雜的操作條件(對離心也是如此)。為了解決這個問題，使用優(yōu)化的膜化學，用一般對顯著污染較不敏感的更親水的切向流微濾膜。傳統(tǒng)上，絮凝一般用來團聚不可變形的固體顆粒。例如，因為它們的小粒徑而非常難以過濾的超微粘土或二氧化鈦顆粒的稀懸浮液可以化學絮凝并由此容易地分離，因為這些超微顆粒的大小通過更快沉降的團聚絮狀物的形成而大大增加，從而因為濾餅內的大流量通道而更快過濾。但是，當化學絮凝用于mAb原料或其他生物分子/細胞原料時，因為這些生物分子材料的生物學特征的性質，所得的團聚是獨特的，并且完全不同于土材料和金屬氧化物的不可變形的固體顆粒。大多數固體不可變形的顆粒如土材料或金屬氧化物具有遠高于水的密度。因此，一旦這些小顆粒絮凝，它們的粒徑大大增加，并且所得的絮狀物通過重力迅速沉降(即，以分鐘計)。相比之下，細胞、mAb和其他生物分子物質由氨基酸和水組成，并且具有與水的密度非常接近的密度。因此，絮凝的細胞和其他生物分子不容易沉淀，并且通常在沉降發(fā)生之前經歷數小時。另一問題是相對低密度的絮凝細胞團，其通常形成蓬松的團，占據顯著部分的進料體積但不形成壓實的濾餅。而且，因為顆粒的生物來源，絮狀物易碎，并且往往在壓力下容易分解。為了這個原因，大多數常規(guī)的固體-液體分離方法雖然可用于固體顆粒系統(tǒng)，但是不能絮凝細胞團如mAb原料。據認為顆粒截留包括通過疏水、離子和其他相互作用來大小排阻和吸附。污染機制可以包括孔阻塞、濾餅形成和/或孔收縮。深層濾器是有利的，因為它們非常有效地去除污染物并且是一次性形式，從而消除了與可重復使用的硬件設施相關的驗證和污染問題，例如在使用離心時遇到的那些問題。但是，深層濾器目前不能操作高滴度mAb過程的典型的高固體進料流，因此常在離心后使用深層濾器。未澄清的細胞培養(yǎng)上清中存在的高顆粒負荷和高濁度為通過單獨的深層過濾進行初步澄清增加了挑戰(zhàn)。但是，深層濾器目前不能操作高固體進料流的初步澄清，并且通常必須在離心或切向流微濾之后使用。未澄清的細胞本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種通過深層過濾但不使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微濾步驟來澄清包含所關注的靶生物分子以及多種細胞碎片和/或膠體顆粒的進料的方法，所述方法包括：a)提供具有多孔深層濾器介質的深層過濾裝置；b)提供包含所關注的靶生物分子以及多種細胞碎片和/或膠體顆粒的進料；c)使所述深層濾器介質與所述進料接觸；以及d)分離所述進料中的所關注的靶生物分子與所述細胞碎片和膠體顆粒但不使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微濾步驟。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.07.08 US 61/571,9941.一種通過深層過濾但不使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微濾步驟來澄清包含所關注的靶生物分子以及多種細胞碎片和/或膠體顆粒的進料的方法，所述方法包括：a)提供具有多孔深層濾器介質的深層過濾裝置，所述深層濾器介質具有至少6層非織造纖維的分級層，所述分級層具有0.3cm-3cm的總厚度，所述孔具有>25μm的標稱孔徑評級，并且所述多孔深層濾器介質是各向異性的；b)提供包含所關注的靶生物分子以及多種細胞碎片和/或膠體顆粒的進料，并且將化學絮凝劑加入所述進料中，從而形成包含多種絮凝的細胞碎片和膠體顆粒的化學絮凝的進料；c)使所述深層濾器介質與所述化學絮凝的進料接觸；以及d)分離所述進料中的所關注的靶生物分子與所述細胞碎片和膠體顆粒但不使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微濾步驟。2.權利要求1的方法，其中所述多孔深層濾器介質是各向異性的，所述孔具有>25μm的標稱孔徑評級，并且所述濾器絮凝的進料具有>3％的固體從而導致<20NTU的濁度輸出。3.權利要求1的方法，其中所述細胞碎片和所述膠體顆粒具有0.5μm-200μm的粒徑分布，并且平均粒徑大于10μm。4.權利要求1的方法，其中所述深層濾器介質包含非織造纖維的分級層、纖維素和硅藻土的復合物，所述復合物具有足以過濾化學絮凝的原料的開放標稱孔徑評級。5.權利要求1的方法，其中所關注的靶生物分子包括單克隆抗體、多克隆抗體和生物治療劑。6.權利要求1的方法，其中所述化學絮凝劑為聚合物或酸。7.權利要求1的方法，其中所述化學絮凝劑為智能聚合物。8.權利要求7的方法，其中所述智能聚合物為修飾的多胺。9.權利要求6的方法，其中所述酸為乙酸。10.權利要求1的方法，其中所述非織造纖維包括聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龍。11.權利要求1的方法，其中所述深層濾器提供>100L/M2/hr的通量，并且去除具有0.5μm-200μm的粒徑分布的絮凝的細胞碎片和膠體顆粒。12.權利要求1的方法，其中所述進料是位于生物反應器中的細胞培養(yǎng)物，并且直接從所述生物反應器裝入所述深層過濾裝置以用于初步澄清加工。13.權利要求12的方法，其中將澄清的細胞培養(yǎng)流出液直接裝入蛋白A結合和洗脫色譜柱以用于色譜加工。14.一種通過深層過濾但不使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微濾步驟來初步澄清包含所關注的生物分子物質以及多種細胞物質的絮凝的進料的方法，所述方法包括：a)提供具有多孔深層濾器介質的深層過濾裝置，所述深層濾器介質具有至少6層非織造纖維的分級層，所述分級層具有0.3cm-3cm的總厚度，所述孔具有>25μm的標稱孔徑評級，并且所述多孔深層濾器介質是各向異性的；b)提供化學絮凝劑；c)提供包含所關注的靶生物分子以及多種細胞物質和/或膠體顆粒的進料；d)將所述化學絮凝劑加入所述進料中；e)形成化學絮凝的進料，其包含絮凝的細胞物質和/或膠體顆粒；f)使所述深層濾器介質與所述化學絮凝的進料接觸；以及g)分離所述進料中的所關注的靶生物分子與所述絮凝的細胞物質和/或絮凝的膠體顆粒但不使用初步澄清離心步驟或初步澄清切向流微濾澄清步驟。15.權利要求14的方法，其中所述多孔深層濾器介質是各向異性的，所述孔具有>25μm的標稱孔徑評級，并且所述絮凝的進料具有>3％的固體從而導致<20NTU的濁度輸出。16.權利要求14的方法，其中所述細胞物質和膠體顆粒具有0.5μm-200μm的粒徑分布，并且平均粒徑大于10μm。17.權利要求14的方法，其中所述深層濾器介質包含非織造纖維的分級層、纖維素和硅藻土的復合物，所述復合物具有足以過濾化學絮凝的進料的開放標稱孔徑評級。18.權利要求14的方法，其中所關注的靶生物分子包括單克隆抗體、多克隆抗體和生物治療劑。19.權利要求14的方法，其中所述化學絮凝劑為聚合物或酸。20.權利要求14的方法，其中所述化學絮凝劑為智能聚合物。21.權利要求20的方法，其中所述智能聚合物為修飾的多胺。22.權利要求19的方法，其中所述酸為乙酸。23.權利要求14的方法，其中所述深層濾器提供>100L/M2的通量，并且去除絮凝的細胞碎片和絮凝的膠體顆粒。24.權利要求14的方法，其中所述進料包括細胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物、微生物發(fā)酵批次、植物提取物...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：N·辛格，程國順，
申請(專利權)人：EMD密理博公司，
類型：
國別省市：