本公開內(nèi)容教導了顯微鏡(1),其具有用于照明樣品或物體(18)的照明光路(20)和用于觀察所述樣品的觀察光路(40,50),所述顯微鏡包括在照明光路中的照明光路聚焦裝置,所述照明光路聚焦裝置限定沿著所述照明光路的照明方向和其垂直方向延伸的基本上二維的樣品或物體照明區(qū)域(22)。所述顯微鏡進一步包括在照明光路中的用于有選擇地照明所述基本上二維的物體照明區(qū)域的部分(10)的照明區(qū)域界定裝置(27),其中所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分在所述照明方向和其垂直方向中的至少一個方向上被界定。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于空間解析熒光相關光譜學的光墊顯微鏡
本專利技術涉及光學顯微鏡,特別是涉及具有限定的焦體(focal volume)的光學顯微鏡,以及適合于樣品濃度波動測定的方法。
技術介紹
擴散從根本上有助于可溶性分子的運動,從而從根本上有助于從細胞分裂和細胞內(nèi)部的信號轉導的調節(jié)到組織起源時的激素調節(jié)以及到發(fā)育過程中的形態(tài)發(fā)生原梯度等許多生物進程的時空方面。在復雜的細胞環(huán)境中量化生物分子的擴散性質是非常有挑戰(zhàn)性的。能夠直接分析擴散過程的裝置和方法是非常少的且都是為個別問題專門定制的。確定生物分子特別是蛋白質的且特別是在它們的自然環(huán)境中的性質和行為,是說明和分析它們的功能和在細胞過程和發(fā)育過程背后的機理的關鍵步驟。熒光相關光譜學(FCS)[1,2]是已知的用于分析分子遷移率的方法,分子遷移率提供了關于標記分子的移動的和不動的部分、它們的擴散性質和濃度、以及相互作用的不同標記分子的共擴散的信息。共焦激光掃描顯微鏡(共焦顯微鏡)是目前選擇用于具有高分辨率的活細胞成像[3]和用于FCS的儀器,因為共焦激光掃描顯微鏡與利用雪崩光電二極管(APD)的超敏光子計數(shù)結合使衍射極限成像(diffraction limited imaging)成為可能。利用共焦激光掃描顯微鏡的FCS測定已經(jīng)被應用于量化發(fā)信號時涉及的蛋白質復合物形成的動力學(由EMBL作出的[4]和由其他人作出的[5]),以研究具有出口能力(export-competent)的mRNP的成熟[6,7]或表征形態(tài)發(fā)生原梯度[8]。利用共焦激光掃描顯微鏡的FCS測定在本公開內(nèi)容中被稱為共焦FCS。然而,由于共焦FCS數(shù)據(jù)采集的一個點接著另一個點的連續(xù)做法所施加的內(nèi)在局限性,連同因失焦的光照而導致的輸入到樣本中的光子的總熒光光子產(chǎn)率過低,使得共焦FCS實驗仍然具有挑戰(zhàn)性[9]。通常,共焦激光掃描顯微鏡僅允許在特定的所選的位置上測定每個細胞的一個或少數(shù)幾個點[4,10,11] ο換而言之,共焦FCS沒有提供足夠的空間解析信息以產(chǎn)生原本能夠將跨越整個細胞或生物體的分散過程和其它來自FCS的蛋白質參數(shù)(例如蛋白質相互作用)視覺化的細胞和其它生物樣品的圖像。已知方法和裝置的另一個缺點是擴散的空間解析成像是有限的或不可能的。
技術實現(xiàn)思路
本公開內(nèi)容教導了具有用于照明樣品或物體的照明光路和用于觀察樣品的觀察光路的顯微鏡。所述顯微鏡包括在所述照明光路中的照明光路聚焦裝置,所述照明光路聚焦裝置限定基本上為二維的樣品或物體照明區(qū)域,所述照明區(qū)域沿著所述照明光路的照明方向和其垂直方向延伸。所述二維物體或樣品照明區(qū)域可以被視為光帶或光片(light-sheet)。由于照明光被成形為所述二維樣品照明區(qū)域,因此所述照明光路聚焦裝置可以被理解為光路成形裝置。所述顯微鏡在所述照明光路中進一步包含照明區(qū)域界定裝置,所述裝置用于有選擇地對所述基本上二維的物體照明區(qū)域的一部分進行照明,其中至少在照明方向和/或其垂直方向上對所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分進行界定。因此所述光帶在照明方向和其垂直方向中的至少一個方向上被界定,基本上形成也稱為“光墊(light pad)”的所述基本上二維的物體照明區(qū)域的一部分。所述基本上二維的物體照明區(qū)域的厚度和所述光墊的厚度比照明方向長度及其垂直方向的寬度小的多。例如,所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分在照明方向上的長度和在垂直方向的寬度可以是所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分的厚度的約6倍或大于約6倍。所述照明光路聚焦(和成形)裝置可以包括柱面透鏡、畸變成形透鏡(anamorphically shaped lens)、一維陣列的球面或非球面透鏡中的至少一個。所述照明光路聚焦(和成形)裝置還可以包括至少一個畸變成形反射鏡。所述照明區(qū)域界定裝置可以至少包括第一孔,其用于在照明方向上界定所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分。所述照明區(qū)域界定裝置還可以至少包括第二孔,其用于在垂直于照明方向的方向上界定所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分。所述第一孔和所述第二孔中的至少一個可以是可調節(jié)的,且可以是圓形光圈或矩形孔或狹縫。所述觀察光路的觀察方向可以是基本垂直于所述照明方向。然后對所述基本上二維的物體照明區(qū)域進行調節(jié)以使其位于檢測物鏡的焦平面內(nèi)。在這方面,所述顯微鏡可以基于具有至少在照明方向上被界定的照明區(qū)域的單一平面照明顯微鏡。本公開內(nèi)容也可以聯(lián)合使用其它觀察方向。所述檢測光路或觀察光路可以包括至少一個允許將檢測區(qū)域界定在所述基本上二維的照明區(qū)域的該部分的空間濾波器??梢允褂靡粋€或多個檢測器像素陣列(如CXD照相機或EM-CXD照相機中的至少一個)來實施樣品的觀察和檢測,利用所述觀察光路將所述基本上二維的物體照明區(qū)域和檢測區(qū)域投射/成像到所述檢測器像素陣列。本公開內(nèi)容還教導了用于觀察/檢測樣品的方法。所述方法包括通過使照明光束聚焦到在所述照明光束的照明方向和其垂直方向延伸的基本上二維的物體照明區(qū)域,來照明樣品的二維部分,其中照明所述二維部分進一步包括界定所述基本上二維的物體照明區(qū)域以有選擇地照明所述基本上二維的物體照明區(qū)域的一部分,其中在照明方向和垂直于照明方向的方向中的至少一個方向上對所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分進行界定??梢詫⑺龌旧隙S的物體照明區(qū)域的該部分稱為光墊。所述方法可以包括移動所述基本上二維的物體照明區(qū)域或所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分中的至少一個使其穿過所述樣品。這可以用于掃描整個所述樣品。通過至少移動一個照明物鏡、通過移動照明光路聚焦裝置或其元件、通過用掃描單元進行掃描、通過移動所述照明區(qū)域界定裝置和通過改變所述照明光路的準直(這可以通過例如用空間光調制器(SLM)或用具有可變曲率的反射鏡操作波前來完成),可以在樣品中以3D的方式進行所述基本上二維的物體照明區(qū)域和/或其所述部分的移動。為了獲得例如熒光分子在所述基本上二維的物體照明區(qū)域和檢測區(qū)域的分布圖像,可以將來自所述樣品的光在一定時間內(nèi)在檢測器像素陣列的每個像素上的記錄合并??梢砸砸幌盗卸虝r間間隔記錄在檢測器像素陣列的每個像素上的來自所述樣品的光,可以將時空相關性分析應用于所述記錄,以獲得針對檢測器陣列上的每個像素的FCS數(shù)據(jù)。所述方法可以進一步包括測定在所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分中的信號波動??梢詫υ诿總€像素上或一區(qū)域上或所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分的熒光強度時間追蹤進行波動分析。所述波動分析可以是時間自相關性分析、來自不同像素的信號之間的時間互相關性分析、來自不同光譜通道的信號之間的時間互相關性分析、光子計數(shù)直方圖、來自不同像素的信號之間的光子符合分析、來自不同光譜通道的信號之間的光子符合分析和本領域技術人員已知的其它方法中的至少一種。【附圖說明】當閱讀了參照附圖的詳細說明時,本專利技術的進一步的方面和細節(jié)將變得明顯,其中:圖1顯示了以衍射極限的光墊進行的基于光片的FCS成像;圖2更詳細地顯示了圖1a中的顯微鏡;圖3a至3c示意說明了光學光墊;圖4示意說明了光墊顯微鏡的光學性質;圖5顯示了在溶液中的ID - FCS測定;圖6顯示了細胞培養(yǎng)基對聚焦光片的影響;圖7顯示了在用所述光墊顯微鏡記錄的MDCK細胞內(nèi)和來自果蠅幼蟲的翅成蟲盤內(nèi)的蛋白質濃度和遷移率的本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
顯微鏡,其具有用于照明樣品(8)的照明光路(20)和至少一個用于觀察所述樣品(8)的觀察光路(40,50),所述顯微鏡包括在所述照明光路(20)中的照明光路聚焦裝置(23),所述照明光路聚焦裝置(23)限定基本上二維的物體照明區(qū)域(22),所述物體照明區(qū)域(22)沿著所述照明光路(20)的照明方向和其垂直方向延伸,和在所述照明光路(20)中的照明區(qū)域界定裝置(27,29),所述照明區(qū)域界定裝置(27,29)用于有選擇地照明所述基本上二維的物體照明區(qū)域(22)的一部分(10),其中所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分(10)在所述照明方向和所述垂直方向中的至少一個方向上被界定。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.02.14 US 61/442,6161.顯微鏡,其具有用于照明樣品(8)的照明光路(20)和至少一個用于觀察所述樣品(8)的觀察光路(40,50),所述顯微鏡包括在所述照明光路(20)中的照明光路聚焦裝置(23),所述照明光路聚焦裝置(23)限定基本上二維的物體照明區(qū)域(22),所述物體照明區(qū)域(22)沿著所述照明光路(20)的照明方向和其垂直方向延伸,和 在所述照明光路(20)中的照明區(qū)域界定裝置(27,29),所述照明區(qū)域界定裝置(27,29)用于有選擇地照明所述基本上二維的物體照明區(qū)域(22)的一部分(10),其中所述基本上二維的物體照明區(qū)域的該部分(10)在所述照明方向和所述垂直方向中的至少一個方向上被界定。2.如權利要求1所述的顯微鏡,其中,所述照明光路聚焦裝置(23)包括柱面透鏡(23)、畸變成形透鏡、一維陣列的球面透鏡或一維陣列的非球面透鏡中的至少一個。3.如權利要求1或2所述的顯微鏡,其中,所述照明光路聚焦裝置(23)包括至少一個畸變成形反射鏡。4.如上述任一項權利要求所述的顯微鏡,其中,所述照明區(qū)域界定裝置(25)至少包括第一孔(29),所述第一孔(29)用于在所述照明方向界定所述基本上二維的物體照明區(qū)域(22)的所述部分。5.如上述任一項權利要求所述的顯微鏡,其中,所述照明區(qū)域界定裝置至少包括第二孔(27),所述第二孔(27)用于在所述照明方向的垂直方向上界定所述基本上二維的物體照明區(qū)域的所述部分。6.如上述任一項權利要求所述的顯微鏡,其中,所述照明區(qū)域界定裝置(23,27)包括光束整形器。7.如上述任一項權利要求所述的顯微鏡,其中,所述至少一個觀察光路(40,50)的觀察方向是與所述照明方向和所述基本上二維的物體照明區(qū)域(22)基本垂直的。8.如上述任一項權利要求所述的顯微鏡,其進一步包括在檢測光路(50)中的可調...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員:麥克爾·克諾普,馬爾特·瓦克斯穆特,熱雷米·卡普拉德,
申請(專利權)人:歐洲分子生物學實驗室EMBL,
類型:
國別省市:
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