本發明專利技術提供了一種液相片段縮合制備胸腺肽α1的方法，屬于生化技術領域。該方法利用高荷載量（≥0.8mmol/g樹脂）的樹脂為起始原料，先采用標準的固相多肽合成(SPPS)技術合成選定結構的高純度肽片段，再采用液相縮合技術連接肽片段，從而獲得高純度(＞99%)的目標肽。相比較固相合成胸腺肽α1的工藝，本發明專利技術避免了12位以后氨基酸偶聯率低的問題，大大提高了胸腺肽α1的收率（達25～30%）；同時固相合成的肽片段不必純化，簡化了后處理工藝，最終采用高效液相色譜純化胸腺肽α1，制備難度降低，制備次數減少，胸腺肽α1的合成成本降低，有利于實現規模化、產業化生產。
【技術實現步驟摘要】
液相片段縮合制備胸腺肽ct1的方法
本專利技術屬于生化
，涉及一種胸腺肽α I的合成方法，尤其涉及一種液相片段縮合制備胸腺肽α I的方法。
技術介紹
胸腺肽α I (又稱胸腺素α 1、胸腺法新)是一種具有下式結構的胸腺肽:Ac_SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。胸腺肽α I是哺乳動物胸腺中存在的單一組分的多肽化合物，是由28個氨基酸殘基和N端氨基酸乙?；瘶嫵傻亩嚯?，是與免疫細胞發育分化相關的分子，具有使T淋巴細胞分化、增殖、提高細胞免疫功能的作用，能破壞被感染的靶細胞，還可激活NK細胞活性，促進與免疫相關的細胞因子的產生。胸腺肽α I的活性較胸腺五肽高10到1000倍，是復合治療慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷綜合癥藥物，在非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤治療中也發揮了較大的作用。胸腺肽α I于1997年由意大利賽生(Sciclone)公司開發上市，現己被24個國家批準用于慢性乙型肝炎(HBV)的治療，在歐美日等國也用于治療丙型肝炎(HCV)、肝細胞癌及增強免疫疾病的治療。1983年公開的美國專利US4504415使用全液相合成胸腺肽α I。最近的胸腺肽α I及其類似物的制備方法主要有兩種，其中一種是采用生物合成技術，在2003年I月I日公開的中國專利技術專利(CN1388133A)中，利用人工基因合成技術獲得胸腺肽α I的全序列。另一種為固相合成方法，“化學 學報”2004年第55卷第2期《胸腺素α I的DIC固相化學合成與鑒定》中提到，以Wang Resin為起始原料，通過激活試劑DIC+HOBt將Fmoc-Asn (Trt) -OH與樹脂相連接；“天津藥學”2001年6月第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α I及其反應途徑》中提到，以HMP樹脂為起始原料，通過激活試劑DCC+ HOBt將Fmoc-Asn(Trt)-OH與樹脂相連接。中國專利 CN200610024610.0、CN200680014615.3、CN200710024406.3、CN200780024724.8、CN201110069876.8 均為固相合成胸腺肽 α I。綜合參考國內外關于胸腺肽α I制備方法以及相關的合成報道文獻，發現這些技術都存在一些不足，主要表現在:①全液相合成費時，需要良好的后處理技術生物合成技術難以規模化生產；③常規固相合成方法難以獲得高純度的胸腺肽α 1，而且收率低(5~10%)，導致生產成本高。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種液相片段縮合制備胸腺肽α I的方法。本專利技術液相片段縮合制備胸腺肽α I的方法，包括在固相支持體上合成胸腺肽α I的側鏈保護肽片段，在液相中縮合側鏈保護肽片段，形成保護的胸腺肽α 1，然后將側鏈和羧基端去保護，獲得目的肽。其具體制備工藝如下:(I)將結構為Fmoc-EVVEEAEN-COOH的側鏈保護肽羧基端進行保護，得到結構為Fmoc-EVVEEAEN-Y的側鏈保護肽片段，并使該肽片段的氨基端去保護，得到結構為nh2-evveeaen-y的側鏈保護肽； (2)采用液相片段縮合方法，將側鏈保護肽Nh2-EvvEEAEN-Y與結構為Fmoc-KEKK-COOH的側鏈保護肽反應，得結構為Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保護的側鏈保護肽；并使該肽片段的氨基端去保護，得nh2-kekkevveeaen-y ； (3)將Fmoc-EITTKD-COOH側鏈保護肽與Leu-OBzl反應得到側鏈保護肽Fmoc-EITTKDL-OBz I，并將氨基Fmoc脫去，得到側鏈保護肽NH2-EI TTKDL-OBz I，再采用液相片段縮合法將NH2-EITTKDL-OBzl側鏈保護肽與結構為Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的側鏈保護肽縮合，產生結構為側鏈保護肽Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl ;再將肽氨基末端乙?；脗孺湵Ｗo肽Ac-SDAAVDTSSE I TTKDL-OBz I，并脫去羧基端Bz I保護，得到Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ； 或將側鏈保護肽NH2-EI TTKDL-OBz I與側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSS-COOH縮合得到側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSE I TTKDL-OBz I，并脫去羧基端Bz I保護，得到側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ； (4)采用液相片段縮合方法將羧基保護的側鏈保護肽nh2-kekkevveeaen-y與結構為Ac-SDAAVDTSSE ITTKDL-C00H 的側鏈保護肽反應，產生結構為 Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保護的側鏈保護肽； (5)將肽Ac-SDAAVDTSSEI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y側鏈保護肽的側鏈和羧基去保護，得目標肽 Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH ； 本專利技術液相片段縮合制備胸腺肽αI的方法也可以由以下工藝步驟完成: Cl)將結構為Fmoc-EVVEEAEN-COOH的側鏈保護肽羧基端進行保護，得到Fmoc-EVVEEAEN-Y ;將肽氨基端去保護，得側鏈保護肽NH2-EVVEEAEN_Y ； (2)采用液相片段縮合方法，使側鏈保護肽Nh2-EWEEAEN-Y與結構為Fmoc-EITTKDLKEKK-COOH 的側鏈保護肽反應，產生結構為 Fmoc-EITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y 羧基保護的側鏈保護肽，并將肽氨基端去保護，得肽nh2-eittkdlkekkevveeaen-y ； (3 )采用液相片段縮合方法，使側鏈保護肽NH2-EI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y與結構為Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的側鏈保護肽反應，產生結構為Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y的羧基保護的側鏈保護肽；再將肽氨基末端乙酰化，得肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y ； 或將肽 NH2-EI TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y 與結構為 Ac-SDAAVDTSS_COOH 的肽反應，產生結構為Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保護的側鏈保護肽； (4)將肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y側鏈保護肽的側鏈和羧基去保護，得目標肽 Ac-SDAAVDTSSE I TTKDLKEKKEVVEEAEN-COOH。上述兩種合成工藝中，各步驟所涉及的片段肽中，Y為叔丁酯基、芐酯基、對硝基芐酯基、三苯甲基。各步驟所涉及的肽片段均是以2-氯代三苯甲基氯樹脂為起始原料，采用經典的固相合成方法而得。上述方法合成的產物經高效液相色譜分析、質譜分析檢測，表明目標肽成功合成。本專利技術相對現有技術具有以下優點: 1、本專利技術利用高荷載量O 0.8mmol/g樹脂)的樹脂為起始原料，先采用標準的固相肽合成(SPPS)技術合成選定結構的高純度肽片段，再采用液相縮合技術使肽片段縮合，從而獲得高純度(> 99本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種液相片段縮合制備胸腺肽α1的方法，包括以下工藝步驟：（1）將結構為Fmoc?EVVEEAEN?COOH的側鏈保護肽羧基端進行保護，得到結構為Fmoc?EVVEEAEN?Y的側鏈保護肽片段，并使該肽片段的氨基端去保護，得到結構為NH2?EVVEEAEN?Y的側鏈保護肽；（2）采用液相片段縮合方法，將側鏈保護肽NH2?EVVEEAEN?Y與結構為Fmoc?KEKK?COOH的側鏈保護肽反應，得結構為Fmoc?KEKKEVVEEAEN?Y的羧基保護的側鏈保護肽；并使該肽片段的氨基端去保護，得NH2?KEKKEVVEEAEN?Y；（3）將Fmoc?EITTKD?COOH側鏈保護肽與Leu?OBzl反應得到側鏈保護肽Fmoc?EITTKDL?OBzl，并將氨基Fmoc脫去，得到側鏈保護肽NH2?EITTKDL?OBzl，再采用液相片段縮合法將NH2?EITTKDL?OBzl側鏈保護肽與結構為Fmoc?SDAAVDTSS?COOH的側鏈保護肽縮合，產生側鏈保護肽Fmoc?SDAAVDTSSEITTKDL?OBzl；再將肽氨基末端乙?；脗孺湵Ｗo肽Ac?SDAAVDTSSEITTKDL?OBzl，并脫去羧基端Bzl保護，得到Ac?SDAAVDTSSEITTKDL?COOH；或將側鏈保護肽NH2?EITTKDL?OBzl與側鏈保護肽Ac?SDAAVDTSS?COOH縮合得到側鏈保護肽Ac?SDAAVDTSSEITTKDL?OBzl，并脫去羧基端Bzl保護，得到側鏈保護肽Ac?SDAAVDTSSEITTKDL?COOH；（4）采用液相片段縮合方法將羧基保護的側鏈保護肽NH2?KEKKEVVEEAEN?Y與結構為?Ac?SDAAVDTSSEITTKDL?COOH的側鏈保護肽反應，產生結構為Ac?SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN?Y羧基保護的側鏈保護肽；（5）將肽Ac?SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN?Y側鏈保護肽的側鏈和羧基去保護，得目標肽Ac?SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN?COOH；上述Y為叔丁酯基、芐酯基、對硝基芐酯基或三苯甲基。...
【技術特征摘要】
1.一種液相片段縮合制備胸腺肽α I的方法，包括以下工藝步驟: (1)將結構為Fmoc-EVVEEAEN-COOH的側鏈保護肽羧基端進行保護，得到結構為Fmoc-EVVEEAEN-Y的側鏈保護肽片段，并使該肽片段的氨基端去保護，得到結構為NH2-EVVEEAEN-Y的側鏈保護肽； (2)采用液相片段縮合方法，將側鏈保護肽NH2-EVVEEAEN-Y與結構為Fmoc-KEKK-COOH的側鏈保護肽反應，得結構為Fmoc-KEKKEVVEEAEN-Y的羧基保護的側鏈保護肽；并使該肽片段的氨基端去保護，得nh2-kekkevveeaen-y ； (3)將Fmoc-EITTKD-COOH側鏈保護肽與Leu-OBzl反應得到側鏈保護肽Fmoc-EITTKDL-OBzl，并將氨基Fmoc脫去，得到側鏈保護肽NH2-EITTKDL-OBzI，再采用液相片段縮合法將NH2-EITTKDL-OBzl側鏈保護肽與結構為Fmoc-SDAAVDTSS-COOH的側鏈保護肽縮合，產生側鏈保護肽Fmoc-SDAAVDTSSEITTKDL-OBzl ;再將肽氨基末端乙?；?，得側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-OBz I，并脫去羧基端Bz I保護，得到Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ； 或將側鏈保護肽NH2-EI TTKDL-OBz I與側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSS-COOH縮合得到側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSE I TTKDL-OBz I，并脫去羧基端Bz I保護，得到側鏈保護肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDL-C00H ； (4)采用液相片段縮合方法將羧基保護的側鏈保護肽nh2-kekkevveeaen-y與結構為Ac-SDAAVDTSSE ITTKDL-C00H 的側鏈保護肽反應，產生結構為 Ac-SDAAVDTSSE ITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y羧基保護的側鏈保護肽； (5)將肽Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-Y側鏈保護肽的側鏈和羧基去保護，得目標肽 Ac-SD...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王銳，常民，彭雅麗，薛宏祥，李明生，
申請(專利權)人：江蘇施美康藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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