一種農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)基因方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供一種農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：配制農(nóng)桿菌菌液，所述農(nóng)桿菌含有外源目的基因；選取剛開(kāi)的棉花花朵，對(duì)其噴灑農(nóng)桿菌菌液。本發(fā)明專利技術(shù)所述農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)基因方法，只需要對(duì)準(zhǔn)花柱柱頭噴灑，然后輕輕綁花，操作簡(jiǎn)單，速度快，操作上幾乎不會(huì)造成機(jī)械性損傷，而且成鈴率高，遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較好。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術(shù)涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供，包括以下步驟：配制農(nóng)桿菌菌液，所述農(nóng)桿菌含有外源目的基因；選取剛開(kāi)的棉花花朵，對(duì)其噴灑農(nóng)桿菌菌液。本專利技術(shù)所述農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)基因方法，只需要對(duì)準(zhǔn)花柱柱頭噴灑，然后輕輕綁花，操作簡(jiǎn)單，速度快，操作上幾乎不會(huì)造成機(jī)械性損傷，而且成鈴率高，遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較好?！緦＠f(shuō)明】
本專利技術(shù)涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及。
技術(shù)介紹
棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，改革開(kāi)放以后中國(guó)已成為世界主要產(chǎn)棉大國(guó)。近60年以來(lái)，全球棉花種植總面積不斷增加，美國(guó)、非洲、蘇聯(lián)及中亞、印度等是主要的出口國(guó)家和地區(qū)。1982年以后，中國(guó)的棉花產(chǎn)量一直位于世界之首，但國(guó)內(nèi)棉花生產(chǎn)卻無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)需求。當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)發(fā)展迅速，并全面推動(dòng)育種技術(shù)的升級(jí)，引領(lǐng)了生物種業(yè)的重大變革，而且在農(nóng)民創(chuàng)收、糧食安全和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。美國(guó)所研制的抗蟲棉大田種植面積已經(jīng)超過(guò)棉花總種植面積的70%，中國(guó)和澳大利亞超過(guò)30%，世界轉(zhuǎn)基因棉花種植總面積達(dá)680萬(wàn)公頃以上，占全球棉花種植總面積的20%。近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，利用生物技術(shù)開(kāi)發(fā)棉花種質(zhì)資源和培育新品種極大地推動(dòng)了棉花遺傳育種的研究進(jìn)程。在棉花轉(zhuǎn)基因方式中，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediated genetransfer)、花粉管通道(Pollen tube pathway)和基因槍(Particle bombardment)三種轉(zhuǎn)化方法?；驑尫ㄊ禽^為常見(jiàn)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化方法，通常選用懸浮的胚性細(xì)胞作為受體材料，但是該方法對(duì)儀器設(shè)備要求很高，并且轉(zhuǎn)基因后代多拷貝，整合效率低且遺傳穩(wěn)定性較差。農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花胚性愈傷轉(zhuǎn)化體系存在周期長(zhǎng)、易受基因型限制、消耗人力和財(cái)力等問(wèn)題。 利用花粉管通道法導(dǎo)入外源基因技術(shù)是我國(guó)學(xué)者周光宇(1979，1980)設(shè)計(jì)了外源DNA直接導(dǎo)入受體的花粉管通道法，并提出了 “DNA片段雜交”的假說(shuō)，這是我國(guó)基因工程研究的一大特色。傳統(tǒng)的花粉管通道技術(shù)方便、費(fèi)用低，但是轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定。農(nóng)桿菌菌液噴霧法又稱噴花法，是近年來(lái)新興的一種簡(jiǎn)單、快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因方法，是將農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法有效結(jié)合的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供，該方法簡(jiǎn)單易行，適合培育轉(zhuǎn)基因海島棉。，包括以下步驟:配制農(nóng)桿菌菌液，所述農(nóng)桿菌含有外源目的基因；選取剛開(kāi)的棉花花朵，對(duì)其噴灑農(nóng)桿菌菌液。所述噴灑方式具體為:用噴壺對(duì)準(zhǔn)花柱柱頭噴灑所述農(nóng)桿菌菌液，農(nóng)桿菌菌液的噴灑量為每朵花f 2mL。所述農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)基因方法，進(jìn)一步還包括步驟:噴灑后，用繩子綁住花瓣，以保持相對(duì)的濕度和菌液活性。噴灑過(guò)農(nóng)桿菌菌液的花朵，向其花柄基部噴灑40 y g / L赤霉素。所述棉花為海島棉。所述海島棉為新海20或新海24。所述農(nóng)桿菌菌液的濃度為:0D600值為0.6。所述農(nóng)桿菌菌液為農(nóng)桿菌重懸于滲透培養(yǎng)基中。所述滲透培養(yǎng)基的配方為:20%蔗糖、I / 2MS、0.1%吐溫-20，pH=6.0。所述外源基因?yàn)閜53。本專利技術(shù)所述農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)基因方法，只需要對(duì)準(zhǔn)花柱柱頭噴灑，然后輕輕綁花，操作簡(jiǎn)單，速度快，操作上幾乎不會(huì)造成機(jī)械性損傷。 農(nóng)桿菌菌液噴霧法處理的新海24的Ttl代植株成鈴率為30.5%，與傳統(tǒng)花粉管通道轉(zhuǎn)化方法成鈴率25%相比有所提高。T1代植株P(guān)CR檢測(cè)，轉(zhuǎn)化率為7.6%。隨機(jī)抽取的轉(zhuǎn)化植株T1代后代中，單拷貝植株所占比例較多。農(nóng)桿菌菌液噴霧法遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較好。【專利附圖】【附圖說(shuō)明】圖lPCAMB1300_p53:gfp 質(zhì)粒圖譜圖21\代陽(yáng)性植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果圖，f 10:轉(zhuǎn)基因植株；11:陽(yáng)性質(zhì)粒；12:非轉(zhuǎn)基因植株；13:陰性對(duì)照；14:DL 200`0marker。圖31\代陽(yáng)性植株的Southern檢測(cè)，1:非轉(zhuǎn)基因植株；2:陰性對(duì)照；3:陽(yáng)性質(zhì)粒；4^13:轉(zhuǎn)基因植株?！揪唧w實(shí)施方式】以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本專利技術(shù)用到的材料、試劑和儀器:植物材料:海島棉品種新海20和新海24由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。菌株材料:農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404。質(zhì)粒材料:PCAMB1300_p53:gfp，見(jiàn)圖1。植物基因組DNA 提取緩沖液:50mmol / L Tris-HCl, pH=8.0 ；IOOmmol / L EDTA, pH=8.0 ；1.5mmoI / LNaCl ；1% SDS ；1% PVP40 ；30 uL3_Mer。電泳緩沖液10XTBE:48.4g / L Tris 堿，11.42mL 冰乙酸，20mL 的 0.5mol / LEDTA (工作緩沖液為I X TBE)Southern雜交配制溶液20 X SSC:175.3g NaCl 和 88.2g 檸檬酸鈉，溶于 IL 去離子水中，pH=7.0 ;Maleic Acid Buffer:11.067g 馬來(lái)酸和 8.766g NaCl 溶于 IL 去離子水中，pH=7.5 ；Washing Buffer:Maleic Acid Buffer 滅菌后加入 3mL 吐溫-20 ;Imol / L Tris-HCl:12.114g Tris-base,溶于 IOOmL 去離子水中，pH=8.0 ;Detection Buffer:1.1688g NaCl 溶于 IOOmL 去離子水中，加 20mL 的 Imol / LTris-HCl (ρΗ=8.0),定容至 200mL, ρΗ=9.5 ；10%SDS:10g SDS，溶于 IOOmL 水中，加熱至 68°C溶解，pH=7.2 ；低嚴(yán)謹(jǐn)洗膜液:2XSSC/ 0.5%SDS ；高嚴(yán)謹(jǐn)洗膜液:0.5 X SSC / 0.5%SDS ；Blocking Solution:用 Maleic Acid Buffer 將 IOXBlocking solution 稀釋 10倍;Antibody Solution:將 Ant1-Digoxigenin-AP (1000Or / min 離心)按 1:5000 用Blocking Solution 稀釋；MS 培養(yǎng)基:。主要儀器:電熱恒溫水槽(DK-8D)、高速離心機(jī)(Centrifuge 5415R)、PCR儀(AG2233IHamburg)、電泳儀(DYY-6D)、凝膠成像系統(tǒng)(FluorChem FC2)。`實(shí)施例1海島棉農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)p53基因本方法，包括以下步驟:制備農(nóng)桿菌菌液:將含有質(zhì)粒PCAMB1300-p53:gfp的農(nóng)桿菌LBA4404重懸于滲透培養(yǎng)基中，將菌液稀釋到0D600值為0.6。滲透培養(yǎng)基配制:20%蔗糖、I / 2MS、0.1%吐溫-20，pH=6.0。噴灑農(nóng)桿菌菌液:在北疆，于7月中旬棉花盛花期的晴天，北京時(shí)間10時(shí)左右，對(duì)剛開(kāi)的花朵掛牌標(biāo)記，花柄上系繩子，在棉花授粉之前，對(duì)標(biāo)記花朵進(jìn)行轉(zhuǎn)基因噴灑。噴灑操作方式為:用食指和中指輕輕夾住花朵，只露出花柱的柱頭，用噴壺對(duì)準(zhǔn)花柱柱頭噴灑菌液f2mL/朵。噴灑過(guò)程中，應(yīng)盡量避免菌液噴灑到花藥上。噴灑后，用繩子綁住花瓣，以保持相對(duì)的濕度和菌液活性。處理時(shí)，繩子不要過(guò)緊，以免損壞柱頭。對(duì)處理后花朵本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種農(nóng)桿菌菌液噴霧轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：配制農(nóng)桿菌菌液，所述農(nóng)桿菌含有外源目的基因；選取剛開(kāi)的棉花花朵，對(duì)其噴灑農(nóng)桿菌菌液。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳全家，曲延英，李瓊，孫國(guó)清，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：