一種DNA文庫及構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種DNA文庫及構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的方法，一種Tale連接單元庫包括16組×n個(gè)雙堿基識別模塊和4組×m個(gè)單堿基識別模塊，每個(gè)雙堿基識別模塊或單堿基識別模塊兩末端均有經(jīng)二類限制性內(nèi)切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端；DNA庫包括與Tale連接單元庫的連接單元數(shù)量相同的質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒包含一個(gè)堿基序列互異的連接單元，連接單元兩末端與原始載體連接處有Bsa?I酶切位點(diǎn)。采用本發(fā)明專利技術(shù)的DNA庫用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒，識別模塊的酶切和連接能在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行，可實(shí)現(xiàn)一步將12-19個(gè)識別模塊連接起來，速度快，效率高，操作簡單，材料易于保存，成本低。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術(shù)公開了一種DNA文庫及構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的方法，一種Tale連接單元庫包括16組×n個(gè)雙堿基識別模塊和4組×m個(gè)單堿基識別模塊，每個(gè)雙堿基識別模塊或單堿基識別模塊兩末端均有經(jīng)二類限制性內(nèi)切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端；DNA庫包括與Tale連接單元庫的連接單元數(shù)量相同的質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒包含一個(gè)堿基序列互異的連接單元，連接單元兩末端與原始載體連接處有Bsa?I酶切位點(diǎn)。采用本專利技術(shù)的DNA庫用于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒，識別模塊的酶切和連接能在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行，可實(shí)現(xiàn)一步將12-19個(gè)識別模塊連接起來，速度快，效率高，操作簡單，材料易于保存，成本低。【專利說明】一種DNA文庫及構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的方法
本專利技術(shù)涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種Tale連接單元庫、包含該Tale連接單元庫中所有Tale連接單元的DNA文庫以及構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的方法。
技術(shù)介紹
按照人類的意愿對基因組進(jìn)行定向靶向修飾一直是許多科學(xué)家的夢想。在內(nèi)源的基因組上特異地刪除或加入我們需要的序列，一方面可以構(gòu)建出各種動物模型用于生物學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病機(jī)理研究，另一方面可以生產(chǎn)動物反應(yīng)器用以廉價(jià)生產(chǎn)我們需要的又很難從其他途徑得到的生物組分。人們一直沒有找到簡單高效的方法對基因組進(jìn)行基因組靶向修飾。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機(jī)交換，其打靶效率非常低，通常只有10_6-10_8，這種打靶方法只在小鼠中得到了廣泛了應(yīng)用，而在其他模式動物及大型哺乳動物中都因效率太低而得不到廣泛應(yīng)用。 2009年兩個(gè)研究組發(fā)現(xiàn)植物病原體Xanthomonas中的一種可以調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(transcription activator-like effector, TALE)表現(xiàn)出DNA結(jié)合特異性，而其識別密碼具有模塊化和簡單化的特點(diǎn)，為科學(xué)家們開發(fā)出更簡易的新型基因組祀向修飾技術(shù)帶來了新希望。TALE與Fokl融合后即形成轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases, TALEN)。TALEs 由數(shù)十個(gè)特異性識別 DNA 的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成。每個(gè)“蛋白模塊”包含34個(gè)氨基酸，第12和13位殘基是祀向識別的關(guān)鍵位點(diǎn),被稱作重復(fù)可變的d1-residues (RVDs)位點(diǎn)。實(shí)踐中，TALEN技術(shù)大大提高了基因打靶效率，應(yīng)用范圍和可操作性，但如何把十幾個(gè)高度重復(fù)的DNA的識別模塊組裝起來成為了 TALEN廣泛應(yīng)用的一個(gè)限制因素。研究者們在怎樣制作TALEN做出了各種各樣的努力。有的采用化學(xué)合成的方法，有的采用兩步分子克隆的方法，也有的采用一步分子克隆的方法。但都有各自的缺陷，因?yàn)樾韬铣傻腄NA高度重復(fù)的序列化學(xué)合成非常困難，成本也非常高；兩步法因?yàn)樾鑳刹竭B接所以材料成本、時(shí)間成本、測序成本都較高；現(xiàn)在公開的唯一一個(gè)可一步連接的方法最多只能連接14個(gè)識別模塊，而自然界中常見的識別模塊的長度為12-23，在實(shí)際應(yīng)用中很多情況需要大于14個(gè)識別模塊的TALEN，14個(gè)片段長度的限制不止影響此種方法應(yīng)用，而且不利于TALEN特異性的提高，并且因其需要酶切，純化，再連接造成操作繁瑣，工藝流程復(fù)雜，酶切純化后的DNA保存困難，特別是單鏈的尾巴容易降解。以前有研究者用單模塊連接TALEN，如連接18個(gè)識別模塊，一個(gè)反應(yīng)連接18個(gè)片段難度非常大，世界范圍內(nèi)還沒有人能實(shí)現(xiàn)；以前也有建立在雙模炔基礎(chǔ)上的研究，但其只能連接14個(gè)識別模塊。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Tale)連接單元庫，利用該連接單元庫可以連接14個(gè)以上的識別模塊。一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子連接單元庫，包括16組Xn個(gè)雙堿基識別模塊和4組Xm個(gè)單堿基識別模塊，每個(gè)雙堿基識別模塊或單堿基識別模塊兩末端均有經(jīng)二類限制性內(nèi)切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端，η表示每組雙堿基識別模塊的數(shù)量，m表示每組單堿基識別模塊的數(shù)量;m ≤ η ;在同一組雙堿基識別模塊中，第i個(gè)雙堿基識別模塊的第二粘性末端與第i+Ι個(gè)雙喊基識別I吳塊的第一粘性末端互補(bǔ)；兩組雙喊基識別|吳塊的粘性末端喊基序列對應(yīng)相同，I ( i ( η-l ；在同一組單堿基識別模塊中，第j個(gè)單堿基識別模塊的第二粘性末端與第j+i個(gè)單堿基識別模塊的第一粘性末端互補(bǔ)；一組單堿基識別模塊的全部單堿基識別模塊的粘性末端堿基序列與一組雙堿基識別模塊的部分或全部雙堿基識別模塊的粘性末端堿基序列對應(yīng)相同，兩組單堿基識別模塊的粘性末端堿基序列對應(yīng)相同，I ≤ j ≤m-lo 本專利技術(shù)相當(dāng)于對連接單元進(jìn)行編號，雙堿基識別模塊為1.....1.....η,單堿基識別模塊為 1、...、j、...、m。其中二類限制性內(nèi)切酶(typeIIs enzyme),可以是Bsa 1、BsmBl、BsmAl、Bbsl 等，優(yōu)選為Bsa I。單個(gè)連接單元的結(jié)構(gòu)如圖5所示，粘性末端有4個(gè)堿基，沿5’ -3’方向，正義鏈的第2~4個(gè)堿基編碼亮氨酸，正義鏈的第I個(gè)堿基為甘氨酸密碼子的最后一個(gè)堿基，正義鏈的最后兩個(gè)堿基為甘氨酸密碼子的前兩個(gè)堿基，反義鏈的第I~3個(gè)堿基的互補(bǔ)序列編碼亮氨酸。當(dāng)η大于等于7時(shí)，可以連接14個(gè)以上的識別模塊，而當(dāng)η等于9，m等于7時(shí)，最多可以連接19個(gè)識別模塊。本專利技術(shù)所述的單堿基識別模塊是指該Tale連接單元編碼的氨基酸能夠識別堿基A、T、C、G0所述的雙堿基識別模塊是指Tale連接單元編碼的氨基酸能夠識別AA、AT、AC、AG、TT、TA、TC、TG、CC、CA、CT、CG、GG、GA、GT、GC。同一組的雙堿基識別模塊或單堿基識別模塊識別同一對堿基或同一個(gè)堿基。由于連接單元本身無法進(jìn)行很好的保存和擴(kuò)增，因此將連接單元插入相應(yīng)的原始載體當(dāng)中，構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以便于保存和擴(kuò)增。本專利技術(shù)還提供了一種DNA文庫，包括數(shù)量與權(quán)利要求1~6任一所述的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子連接單元庫的連接單元數(shù)量相同的DNA片段，每個(gè)DNA片段包含一個(gè)堿基序列互異的連接單元，連接單元兩末端與DNA片段的其余部分連接處有二類限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。也就是說，利用二類限制性內(nèi)切酶(type IIs enzyme)對DNA片段進(jìn)行酶切,就可以得到所述的Tale連接單元。所述的DNA片段可以是重組質(zhì)粒，也可以是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)選擇為重組質(zhì)粒時(shí)，原始載體可以是PMD18-T載體、topo、pucl9、或pucl8。本專利技術(shù)又提供了一種構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒的方法，包括:(I)根據(jù)目的基因的靶序列確定識別模塊，從所述的DNA文庫中選取各識別模塊對應(yīng)的DNA片段；(2)在同一體系內(nèi)，采用二類限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將各DNA片段中連接單元連接入帶有DNA切割蛋白以及轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架N端和C端的載體中；(3)用消化線性DNA的酶進(jìn)行消化處理，得到轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶質(zhì)粒。該方法中，各識別模塊之間能夠順序連接；同時(shí)，識別模塊之間、識別模塊與載體之間一旦連接上，就無法被二類限制性內(nèi)切酶(type IIs enzyme)再切開,所以本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子連接單元庫，其特征在于，包括16組×n個(gè)雙堿基識別模塊和4組×m個(gè)單堿基識別模塊，每個(gè)雙堿基識別模塊或單堿基識別模塊兩末端均有經(jīng)二類限制性內(nèi)切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端，n表示每組雙堿基識別模塊的數(shù)量，m表示每組單堿基識別模塊的數(shù)量；m、n為自然數(shù)，且m≤n；在同一組雙堿基識別模塊中，第i個(gè)雙堿基識別模塊的第二粘性末端與第i+1個(gè)雙堿基識別模塊的第一粘性末端互補(bǔ)；兩組雙堿基識別模塊的粘性末端堿基序列一一對應(yīng)相同，1≤i≤n?1；在同一組單堿基識別模塊中，第j個(gè)單堿基識別模塊的第二粘性末端與第j+1個(gè)單堿基識別模塊的第一粘性末端互補(bǔ)；一組單堿基識別模塊的全部單堿基識別模塊的粘性末端堿基序列與一組雙堿基識別模塊的部分或全部雙堿基識別模塊的粘性末端堿基序列一一對應(yīng)相同，兩組單堿基識別模塊的粘性末端堿基序列一一對應(yīng)相同，1≤j≤m?1。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙金龍，吳昭，
申請(專利權(quán))人：上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31