一種制備hEGF粗制品的方法技術

本發明專利技術公開了一種制備hEGF制品的方法。該方法為收集吸附尿蛋白后的吸附劑，將洗脫下來的尿蛋白溶液上已經平衡好的金屬螯合層析柱，hEGF結合到該金屬螯合層析柱上，收集hEGF組分洗脫峰，經過硫酸銨沉淀，制備hEGF粗制品。該方法是一種從男性尿液中制備hEGF粗制品的方法，該粗制品可用于hEGF的后續純化，純化出的hEGF不含使人體產生過敏反應的異源蛋白，該方法操作簡便,便于工業化生產，為規模化制備人來源的hEGF提供了基礎。

【技術實現步驟摘要】
—種制備hEGF粗制品的方法
本專利技術涉及一種尿蛋白的提取方法，尤其涉及一種hEGF粗制品的制備方法。
技術介紹
人尿中含有三百多種蛋白質，尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶等都已經從人尿中分離出來，并在疾病治療等領域發揮了重要的作用。人表皮生長因子(HumanEpidernal Growth Factor,又叫 Urogastrone,尿抑胃素，以下簡稱為hEGF)，于70年代首次從人尿中分離。hEGF是人生長因子中的一種，是由53個氨基酸組成的相對分子量為604?a，等電點為4.6左右的小分子多肽。hEGF含有三對分子內二硫鍵，因此對酸、堿、熱等理化因素均較穩定。目前，hEGF已被開發成治療抑制胃酸分泌的注射劑和燒燙傷、潰瘍、各類創傷以及角膜損傷的外用藥物和美容護膚品。中國人尿資源非常豐富，依賴于這一有利條件，尿蛋白產業從上世紀七十年代末就已經開始發展起來，至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的規模化生產方式主要有兩種，方法一:收集尿液，運輸到加工點，用吸附劑吸附尿蛋白，由于尿液來源分散，收集成本高，加上城市衛生改造，收集已經越來越困難；方法二:直接將吸附尿蛋白的樹脂放置在廁所進行連續在線吸附，然后收集吸附后的樹脂運回加工點進行分離純化。這種方法對環境無污染，可以在大中城市進行收集，尿源集中，運輸成本較低，極大地擴大了尿蛋白的收集區域。尿蛋白產品目前主要的生產過程是:首先，在各地經過尿蛋白的吸附、洗脫、沉淀等步驟制備尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品經過下游的分離純化和精制，制備尿蛋白原料藥；最后灌裝成品制劑，用于臨床。目前，hEGF來源有兩種。第一，hEGF主要通過基因工程制備，名稱為重組hEGF(Recombind Human Epiderma`l Growth Factor,以下簡稱 rhEGF)。主要的制備途徑有原核表達、哺乳動物細胞表達、酵母表達等，通過收集發酵液，進行分離純化得到rhEGF。第二，從人尿中分離提取hEGF。目前，主要是從孕婦尿液中經過復雜的純化過程得到hEGF。通過基因工程制備的rhEGF雖然易純化、產量高，但由于其中存在微量的異源蛋白，rhEGF容易引起過敏反應，因此，目前只作為外用藥物使用。從尿液中制備的hEGF，結構和性質和人體完全相同，不存在異源蛋白，可作為注射劑進入臨床。目前國外已經有進行臨床研究的案例。但是hEGF目前多數從孕婦尿中分離得到，孕婦尿難于收集且產量低，限制了 hEGF的應用。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術存在的不足，提供一種從男性尿液中制備hEGF粗制品的方法，該粗制品可用于hEGF的后續純化，純化出的hEGF不含使人體產生過敏反應的異源蛋白，該方法操作簡便便于工業化生產出hEGF粗制品，為從自然來源中提取hEGF提供基礎。為實現上述目的，本專利技術制備hEGF粗制品的方法的技術方案是: ，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，收集含有hEGF組分的洗脫峰，經過硫酸銨沉淀，制備hEGF粗制品。所述的制備hEGF粗制品的方法，包括如下步驟: 1)將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池或尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白； 2)收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗、解吸處理； 3)超濾濃縮； 4)超濾濃縮液調節pH和電導，上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，再用平衡液沖洗； 5)用洗脫溶液洗脫，收集含有hEGF組分的洗脫峰； 6)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2— 10小時后，收集沉淀，得到hEGF粗制品。所述的金屬螯合層析柱螯合的金屬離子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一種。優選 Cu2+。金屬螯合層析柱平衡液為0.01 - 0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2 — 2.0M,ρΗ6.0-8.0。優選0.02Μ磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.5Μ。所述的金屬螯合層析柱洗脫溶液為0.05-0.2Μ磷酸鹽緩沖液，NH4Cl濃度為.0.5-1.0Μ, ρΗ6.0-8.0。優選 0.1M 磷酸鹽緩沖液，0.8Μ 的 NH4Cl, ρΗ7.5。步驟4中超濾濃縮液調節ρΗ6 - 8，電導0.5 — 10mS/cm。優選pH8.0,電導2.2mS/cm。在步驟4和步驟5之間，增加一個沖洗步驟，使用pH3 - 6，NaCl濃度≤0.2M來沖洗金屬螯合層析柱，所述的沖洗液緩沖介質為0.01 — 0.2M磷酸鹽或醋酸鹽。優選PH5.0的0.1M醋酸鹽緩沖液，氯化鈉濃度為0.1M。本專利技術與現有技術相比，具有以下優點:首次實現了從男性尿液中富集及分離hEGF，并使得從人來源中提取hEGF的方法可以工業化實施；首次引入了金屬螯合層析工藝，有效分離hEGF，大大降低了 hEGF后續純化的難度，純化出的hEGF不含使人體產生過敏反應的異源蛋白；采用高效離子交換吸附劑，放置尿斗或尿池中，進行尿蛋白的在線富集，避免了尿液的大規模運輸，降低了成本。【附圖說明】圖1為制備hEGF粗制品的方法的流程圖。【具體實施方式】下面結合【具體實施方式】，進一步闡明本專利技術，應理解這些實施方式僅用于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的范圍，在閱讀了本專利技術之后，本領域技術人員對本專利技術的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。，包括如下步驟: 1)將離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池或尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白； 2)收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗、解吸處理； 3)超濾濃縮； 4)超濾濃縮液調節pH6— 8,電導0.5 — 10mS/cm,優選ρΗ8.0,電導2.2mS/cm,上已平衡好的金屬螯合層析柱，再用平衡液沖洗，平衡液為0.01 - 0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2 — 2.0M, pH6.0-8.0，優選0.02M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.5M，螯合金屬離子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+ 中的任意一種，優選 Cu2+ ； 5)用洗脫液洗脫，收集洗脫峰。所述的洗脫溶液為0.05-0.2M磷酸鹽緩沖液，NH4Cl濃度為 0.5-1.0M, ρΗ6.0-8.0，優選 0.1M 磷酸鹽緩沖液，pH7.5,0.8MNH4C1 ； 6)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2- 10小時后，收集沉淀，得到hEGF粗制品。在步驟4和步驟5之間，增加一個沖洗步驟，使用pH3 - 6，NaCl濃度≤0.2M來沖洗金屬螯合層析柱，所述的沖洗液緩沖介質為0.01 - 0.2M磷酸鹽或醋酸鹽，優選PH5.0的0.1M醋酸鹽緩沖液，氯化鈉濃度為0.1M。實例一 1.大孔型離子交換樹脂100公斤作為吸附劑，經過再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過樹脂，24小時后，收集吸附尿蛋白的樹脂，將吸附后樹脂用飲用水沖洗干凈、裝柱；用IM的NaCl進行洗脫，收集洗脫峰。2.用截留分子量IOK的超濾膜進行超濾濃縮，調節pH7.0,電導0.5mS/cm，上已平衡好的金屬離子為Cu2+的金屬螯合層析柱(Chelating sepharo本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備hEGF粗制品的方法，其特征在于：收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，收集含有hEGF組分的洗脫峰，經過硫酸銨沉淀，制備hEGF粗制品。

【技術特征摘要】
1.一種制備hEGF粗制品的方法，其特征在于:收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，收集含有hEGF組分的洗脫峰，經過硫Ife按沉淀，制備hEGF粗制品。2.根據權利要求1所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于，包括如下步驟: 將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池或尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白； 收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗、解吸處理； 超濾濃縮； 超濾濃縮液調節PH和電導，上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，再用平衡液沖洗； 用洗脫溶液洗脫，收集含有hEGF組分的洗脫峰； 在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 - 10小時后，收集沉淀，得 到hEGF粗制品。3.根據權利要求1或2所述的制備hEGF粗制品的方法，其特征在于:所述的金屬螯合層析柱螯合的金屬離子是Cu2+、Z...

【專利技術屬性】
技術研發人員：苗丕渠，蘇古方，吳蓉蓉，侯曉彥，
申請(專利權)人：揚州艾迪生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：