一種具有腫瘤靶向性的非病毒陽離子基因載體及其制備方法，屬于生物醫藥技術領域。是由聚醚酰亞胺PEI、油酰氯OA和葉酸FA制備得到，交聯的陽離子聚合物聚醚酰亞胺-油酰氯PEI-OA形成疏水性核心結構，由具有腫瘤靶向性的配體葉酸FA作為外殼，賦予該傳遞系統穿透細胞膜的功能，形成性質穩定、生物兼容性好的靶向非病毒基因傳遞系統。其中，PEI與OA的摩爾比為1:1～4:1，PEI-OA與FA的摩爾比為1:1～20:1。制備的FA-PEI-OA載體系統具有腫瘤靶向性、毒性小、轉染效率高等特點，可作為核酸藥物的有效傳遞系統。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥
，具體涉及。
技術介紹
合成高分子材料在基因治療中是一個非常有前景的領域，利用這些合成高分子作為靶向載體，應用于癌癥治療正得到迅猛的發展。以特定的基因作為靶位的治療策略成了國際制藥領域的一大研究和開發的熱點?；蛑委熢趯嶋H應用過程中，存在的最大障礙是缺少安全、高效的載體系統。目前所采用的載體主要分為兩大類，即病毒載體和非病毒載體。非病毒載體是將外源基因用各種人工的或天然的材料包裝起來形成的傳遞系統，主要包括陽離子聚合物和磷脂。非病毒載體具有安全性好、重復性高、制備簡單等多項優點。病毒載體是將外源基因包裝到天然病毒的外殼中，利用病毒對宿主細胞的感染性將外源基因導入細胞中。病毒載體因具有轉導效率及表達效率高的特點而得到廣泛應用，但其本身存在不可避免的安全性問題，如表達外源基因時間短、免疫原性強、易引發強烈的炎癥反應和免疫反應、毒性較大等。因此，開發全新的非病毒載體至關重要。根據基因藥物的理化性質，通常將載體系統設計成表面帶有正電荷的微粒給藥體系，通過靜電的作用與帶負電的核酸形成復合物，復合物經內吞等方式進入細胞，然后釋放出基因藥物，轉運至 細胞核并在核內得以表達。這種極簡單的靜電吸附原理，已經貫穿于整個非病毒類載體20多年的研究中。PEI (聚醚酰亞胺)是目前常用的陽離子轉染聚合物，但是由于其毒性較高，轉染效率低等缺陷限制了其使用，對PEI進行改性研究，同時加上靶向基團，增加其轉染效率，并減少毒性，使其成為有效的非病毒傳遞系統，具有重大意義。
技術實現思路
本專利技術提供了一種新型的具有腫瘤靶向性的非病毒陽離子基因載體(FA-PE1-0A，在該載體中，PEI與油酰氯摩爾比為1:1~4:1，PE1-OA與葉酸的摩爾比為1:1~20:1)及其制備方法，該載體是由交聯的陽離子聚合物聚醚酰亞胺-油酰氯(PE1-OA)形成疏水性核心結構，由具有腫瘤靶向性的配體葉酸(FA)作為外殼，賦予該傳遞系統穿透細胞膜的功能，形成性質穩定、生物兼容性好的靶向非病毒基因傳遞系統。制備的FA-PE1-OA載體系統具有腫瘤靶向性、毒性小、轉染效率高等特點，可作為核酸藥物的有效傳遞系統。本專利技術同時提供了載體系統(FA-PE1-OA)與核酸(DNA/RNA)形成納米復合物的制備方法，該納米復合物用來評價專利中載體的傳遞效果。本專利技術涉及到一種含有PE1、油酰氯(OA)和靶向配體葉酸(FA)的基因載體，該載體制備方法如下:(I)PE1-OA的合成JfPEI溶于二氯甲烷中(濃度范圍為0.5~5mg.ml/1)，將油酰氯溶解于三乙胺和二氯甲烷(三乙胺和二氯甲烷的體積比為2:1~8:1)的混合溶液中(油酰氯的濃度范圍為0.2~2mg.mL-1),按照PEI與油酰氯摩爾比為1:1~4:1比例，將油酰氯溶液緩慢地加入到PEI溶液中，并室溫攪拌，控制攪拌轉速為100~500rpm，反應進行6~24h，通過透析除去過量的三乙胺，最后通過真空干燥得到PE1-OA粉末；(2)將步驟(1)得到的PE1-OA粉末使用溶劑溶解后，在DEPC水(焦碳酸二乙酯處理且經高溫滅菌)、PB緩沖液或PBS緩沖液體系中與pH=6~8的葉酸溶液均勻混合(ΡΕΙ-0Α與葉酸的摩爾比為1:1~20:1)，通過靜電吸附作用制得FA-PE1-OA基因載體系統。優選地，PEI的分子量為800~2000Da。優選地，步驟(2)中的溶劑為無水乙醇或氯仿。優選地，透析截留分子量為10~30K，透析時間為8~24h。本專利技術同時涉及一種基因載體系統與核酸(DNA/RNA)復合物的制備，該復合物的制備方法為:將FA-PE1-OA基因載體系統與用DEPC水(焦碳酸二乙酯處理且經高溫滅菌)溶解的DNA/RNA在PBS緩沖液體系中(FA-PE1-OA中PE1-OA與DNA/RNA的摩爾比為1:1~10:1)旋渦混合，室溫孵育(10~30°C )，即得FA-PE1-OA基因載體系統與核酸(DNA/RNA)復合物。優選地，旋渦混合時間為10~30s。優選地，孵育時間為20~60min。 本專利技術涉及的FA-PE1-OA基因載體系統具有較高的轉染效率，具有一定的靶向性，在幾株腫瘤細胞中均表現了低毒高效的特點?！靖綀D說明】圖1:實施例1制備的PE1-OA的1H NMR譜圖;圖2:不同 N/P 比的 PE1-OA 與 pDNA CpDNA 是質粒 DNA，DNA/RNA 中 DNA 的一種)所得復合物(實施例5)的瓊脂糖凝膠電泳圖，最佳N/P比為4:1 ;圖3:不同葉酸濃度的FA-PE1-OA與pDNA所得復合物(實施例6)的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4:不同質量比(FA-PE1-0A與pDNA的質量比)的FA-PE1-0A與pDNA所得復合物(實施例7)的粒徑分布圖；圖5:不同質量比(FA-PE1-0A與pDNA的質量比)的FA-PE1-0A與pDNA所得復合物(實施例7)的Zeta電位圖；圖6:不同質量比(三種載體與pDNA的質量比，其中ΡΕΙ、ΡΕΙ-0Α組作為對照)的載體(PE1、PE1-OA、FA-PE1-0A)與pDNA所得復合物的流式細胞儀測定轉染效率結果圖(Hela細胞系)；圖7:不同質量比(三種載體與pDNA的質量比，其中ΡΕΙ、ΡΕΙ_0Α組作為對照)的載體(PE1、PE1-OA、FA-PE1-0A)與pDNA所得復合物的流式細胞儀測定轉染效率結果圖(A549細胞系)；圖8:不同濃度的FA-PE1-OA載體MTT毒性實驗(實施例10)結果圖(Hela細胞系)；圖9:不同濃度的FA-PE1-OA載體MTT毒性實驗(實施例11)結果圖(A549細胞系)；【具體實施方式】:為了便于理解本專利技術，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本專利技術的闡釋而非對本專利技術的任何形式的限制。實施例1本實施例為非病毒陽離子基因載體(FA-PE1-OA)的制備，制備方法如下:PE1-800溶解在2.5毫升二氯甲烷中(濃度為0.5mg.mL—1)，油酰氯溶解于100 μ L三乙胺和2.5mL 二氯甲烷中(濃度為0.2mg.mL—1)，將油酰氯溶液緩慢地加入到攪拌的PEI溶液中(摩爾比為1:1)。在室溫下，攪拌反應進行8小時，攪拌速度為IOOrpm，通過截留分子量為15K的透析袋除去過量的三乙胺，透析時間為12h。最后，通過真空干燥得到PE1-OA粉末，質量為9.5mg0采用1H NMR對合成的PE1-OA進行300MHz核磁共振氫譜表征，如圖1所示。譜圖顯示:硬脂酸上末端-CH3集團上的氫在0.8ppm處有特征吸收，PEI中(-HN-CH2-CH2-NH-)在2.5~2.8ppm處有特征吸收，對二者進行整合，顯示PE1-OA聚合物一個基本單位中PEI和油酰氯的比例為6.0。將PE1-OA粉末用無水乙醇溶解后制得5mg.mL—1的ΡΕΙ-0Α溶液，取5 μ LPE1-OA的無水乙醇溶液迅速注入到20μ L的PBS緩沖液中，混合均勻后與ρΗ=7.5的葉酸溶液(15mg.mL—1)室溫混合(PE1-OA與葉酸的摩爾比為1:1)，室溫孵育20min，通過靜電吸附作用得到非病毒陽離子基因載體(FA-PE1-0A)，終濃度為2mg.mL'實施例2本實施例為非病毒陽離子基因載體(FA-PE1-OA)的制備本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具有腫瘤靶向性的非病毒陽離子基因載體FA?PEI?OA，其特征在于：是由聚醚酰亞胺PEI、油酰氯OA和葉酸FA制備得到，交聯的陽離子聚合物聚醚酰亞胺?油酰氯PEI?OA形成疏水性核心結構，由具有腫瘤靶向性的配體葉酸FA作為外殼，PEI與OA的摩爾比為1:1～4:1，PEI?OA與FA的摩爾比為1:1～20:1。
【技術特征摘要】
1.一種具有腫瘤靶向性的非病毒陽離子基因載體FA-PE1-OA，其特征在于:是由聚醚酰亞胺PE1、油酰氯OA和葉酸FA制備得到，交聯的陽離子聚合物聚醚酰亞胺-油酰氯PE1-OA形成疏水性核心結構，由具有腫瘤靶向性的配體葉酸FA作為外殼，PEI與OA的摩爾比為1:1~4:1，PE1-OA與FA的摩爾比為1:1~20:1。2.權利要求1所述的具有腫瘤靶向性的非病毒陽離子基因載體FA-PE1-OA的制備方法，其步驟如下: (I)PE1-OA的合成:將聚醚酰亞胺溶于二氯甲烷中，濃度范圍為0.5~5mg -ml-1 ;將油酰氯溶解于三乙胺和二氯甲烷的混合溶液中，三乙胺和二氯甲烷的體積比為2:1~8:1，油酰氯的濃度范圍為0.2~2mg.ml-1按照聚醚酰亞胺與油酰氯摩爾比為1:1~4:1比例，將油酰氯溶液緩慢地加入到聚醚酰亞胺溶液中，并室溫攪拌，控制攪拌轉速為100~...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李劍光，楊爽，滕樂生，滕利榮，孟慶繁，逯家輝，謝晶，王迪，王貞佐，劉艷，程瑛琨，權宇彤，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：
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