本發明專利技術公開了一種誘導動物體外細胞可逆永生化的載體及其應用。本發明專利技術所提供的誘導動物體外細胞可逆永生化的載體含有大腸桿菌復制起始區、氨芐青霉素抗性基因，以及表達盒1和表達盒2；所述表達盒1從上游到下游依次包括如下元件：Ptight、hTERT、IVS、IRES、Hygr和SV40polyA；所述表達盒2從上游到下游依次包括如下元件：PCMV、rtTA-Advanced和SV40polyA；所述表達盒1和所述表達盒2方向相反。實驗證明，利用本發明專利技術所提供的環形載體，可實現對動物細胞壽命的可逆調節，提高體外細胞遺傳操作的效率。本發明專利技術為動物遺傳修飾或醫學細胞治療等應用提供安全的細胞材料具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
一種誘導動物體外細胞可逆永生化的載體及其應用
本專利技術屬于基因工程領域，涉及一種誘導動物體外細胞可逆永生化的載體及其應用。
技術介紹
體外培養的動物細胞在生物學研究、動物克隆和轉基因以及細胞治療上均有重要應用價值，但從動物體組織分離的原代細胞增殖代數有限，不利于體外長期培養，特別是不利于遺傳修飾和組織工程等長期培養過程。通過表達一定的基因可以使原代培養的體細胞壽命延長，即獲得永生化能力，其中人端粒酶催化亞基基因(hTERT)是常用的基因之一。已經證實，在細胞中表達人端粒酶催化亞基基因(hTERT)可以使細胞獲得功能性的端粒酶，防止端粒縮短而使細胞壽命得以延長。但是，永生化細胞或長壽細胞并不完全符合動物克隆或細胞治療的要求，長期穩定表達這些“永生化”基因的細胞不能用于體細胞克隆或細胞治療，因為克隆后易導致腫瘤發生或者胚胎發育停止。現有技術主要采用持續表達hTERT基因的方法延長細胞壽命，但一旦轉入hTERT基因后無法關閉其表達，結果是細胞發生永生化或癌化。因此，在完成體外基因打靶等遺傳修飾后，在進行核移植前必須使導入的“永生化”基因關閉，從而變成正常的細胞，才可能生產出克隆動物。因此，必須構建出細胞壽命可逆的細胞系。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種誘導動物體外細胞可逆永生化的載體。本專利技術所提供的誘導動物體外細胞可逆永生化的載體為環形載體(記為環形載體A)。所述環形載體A，含有大腸桿菌復制起始區(Col Elori)、氨芐青霉素抗性基因(Ampr),以及表達盒I和表達盒2 ;所述表達盒I從上游到下游依次包括如下元件:Ptight、hTERT、IVS、IRES、Hygr, SV40polyA ;所述表達盒2從上游到下游依次包括如下元件:PCMV、rtTA-Advanced和 SV40polyA。在本專利技術中,所述表達盒I和所述表達盒2方向相反。在所述環形載體A中，所述大腸桿菌復制起始區(Col Elori)的序列具體可為序列表中序列I的第7611-8254位；所述氨芐青霉素抗性基因(Amplr)的序列具體可為序列表中序列I的第6604-7466位。在所述表達盒I中，所述Ptight由TREnwd和Pniincw Λ組成；所述TREnwd的序列如序列表中序列I的第2-251位所示；所述Ρ^μμυδ的序列如序列表中序列I的第257-316位所示；所述hTERT的序列如序列表中序列I的第373-3829位所示；所述IVS的序列如序列表中序列I的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列I的第4223-4814位所示；所述Hyglr的序列如序列表中序列I的第4838-5869位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第6199-6399位所不。在所述表達盒2中，所述P.的序列如序列表中序列I的第10512-9921位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列I的第9823-9077位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第9054-8621位所示。進一步，所述表達盒I的核苷酸序列為序列表中序列I的第2-6399位；所述表達盒2的核苷酸序列為序列表中序列I的第10512-8621位。更加具體的，所述環形載體A的核苷酸序列具體為序列表中序列I。本專利技術的再一個目的是提供所述環形載體A的制備方法。所述環形載體A的制備方法，具體可包括如下步驟:(I)用 Xho I 酶切 pTet-On Advanced 質粒，回收 4.2kb 片段(含有 PCMV、rtTA-Advanced 和 SV40polyA,以及 Col Elori 和 Ampr);用 Xho I 酶切 pTRE-Tight 質粒，回收0.6kb片段(含有Ptight、MCS和SV40polyA);將所述4.2kb片段與所述0.6kb片段反向連接，得到重組載體，記作pTet-On Tight ；(2)用 Xba I 和 Nhe I 酶切 pIREShyg3 質粒，回收 2.3kb 片段(含有 IVS、IRES和Hyglr);用Nhe I酶切所述pTet_0n Tight,回收線性載體骨架片段，記為片段A ;將所述2.3kb片段與所述片段A正向連接,得到重組載體,記作pTet-On IREShyg ；(3)用 EcoR I 酶切 pLPC-hTERT 質粒，回收 3.4kb 片段(含有 hTERT);將所述 3.4kb片段的末端補平，得到平齊末端片段；用Eco47 III酶切所述pTet-On IREShyg，回收線性載體骨架片段，記為片段B ;將所述平齊末端片段與所述片段B正向連接，得到重組載體，記作pTet-On hTERT ;所述pTet-0n hTERT即為本專利技術所保護的所述環形載體A。所述環形載體A (pTet-On hTERT)在誘導動物體外細胞可逆永生化中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術還提供了一種用于誘導動物體外細胞可逆永生化的組合物。該組合物由所述環形載體A和強力霉素組成。在本專利技術中，以上所有的所述動物體外細胞為動物體外原代細胞,具體可為綿羊胎兒成纖維細胞。在本專利技術中，具體是通過如下實現對所述動物體外細胞(如綿羊胎兒成纖維細胞)的可逆永生化的:在四環素類似物一強力霉素(Doxycyclinejox)存在的情況下，Dox與所述rtTA-Advanced元件表達的蛋白rtTA結合，作用于所述Ptight元件，從而所述PminaiVZ^動目的基因(如所述hTERT)的表達，；在沒有Dox的情況下，rtTA不能作用于所述Ptight元件，故目的基因(如所述hTERT)不能表達。因此通過添加或撤除Dox來對目的基因(如所述hTERT)實行可控表達。當所述hTERT表達時，所述動物體外細胞(如綿羊胎兒成纖維細胞)處于永生化開啟狀態；當所述hTERT不表達時，所述動物體外細胞(如綿羊胎兒成纖維細胞)處于永生化關閉狀態本專利技術的還一個目的是提供另一種環形載體(記為環形載體B)。本專利技術所提供的環形載體B，為所述環形載體A缺失所述hTERT后形成的環形載體。所述環形載體B，含有大腸桿菌復制起始區、氨芐青霉素抗性基因，以及表達盒I和表達盒2 ;所述表達盒I從上游到下游依次包括如下元件:Ptight、IVS、IRES、Hygr和SV40polyA ;所述表達盒2從上游到下游依次包括如下元件rtTA-Advanced和SV40polyA ;所述表達盒I和所述表達盒2方向相反。在所述環形載體B中，所述大腸桿菌復制起始區的序列具體為序列表中序列I的第7611-8254位；所述氨芐青霉素抗性基因的序列具體為序列表中序列I的第6604-7466位；在所述表達盒I中，所述Ptight由TREnwd和Pniinaw Λ組成；所述TREnwd的序列如序列表中序列I的第2-251位所示；所述Ρ^μμυδ的序列如序列表中序列I的第257-316位所示；所述IVS的序列如序列表中序列I的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列I的第4223-4814位所示；所述Hyglr的序列如序列表中序列I的第4838-5869位所示；所述SV40polyA的序列如序列 表中序列I的第6199-6399位本文檔來自技高網...
【技術保護點】
環形載體A，含有大腸桿菌復制起始區、氨芐青霉素抗性基因，以及表達盒1和表達盒2，其特征在于：所述表達盒1從上游到下游依次包括如下元件：Ptight、hTERT、IVS、IRES、Hygr和SV40polyA；所述表達盒2從上游到下游依次包括如下元件：PCMV、rtTA?Advanced和SV40polyA。
【技術特征摘要】
1.環形載體A，含有大腸桿菌復制起始區、氨芐青霉素抗性基因，以及表達盒I和表達盒2，其特征在于:所述表達盒I從上游到下游依次包括如下元件:Ptight、hTERT、IVS、IRES、Hygr和SV40polyA ;所述表達盒2從上游到下游依次包括如下元件Tai^rtTA-Advanced和SV40polyAo2.根據權利要求1所述的環形載體A，其特征在于:所述大腸桿菌復制起始區的序列為序列表中序列I的第7611-8254位；所述氨芐青霉素抗性基因的序列為序列表中序列I的第6604-7466位；和/或 在所述表達盒I中，所述Ptight由TREmtxl和Pmina^組成；所述TREnrod的序列如序列表中序列I的第2-251位所示；所述？__八的序列如序列表中序列I的第257-316位所示；所述hTERT的序列如序列表中序列I的第373-3829位所示；所述IVS的序列如序列表中序列I的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列I的第4223-4814位所示；所述Hygr的序列如序列表中序列I的第4838-5869位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第6199-6399位所示；和/或 在所述表達盒2中，所述Pqw的序列如序列表中序列I的第10512-9921位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列I的第9823-9077位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列I的第9054-8621位所示。3.根據權利要求1或2所述的環形載體A，其特征在于:所述表達盒I的核苷酸序列為序列表中序列I的第2-6399位；和/或 所述表達盒2的核苷酸序列為序列表中序列I的第10512-8621位。4.根據權利要求1-3中任一所述的環形載體A，其特征在于:所述環形載體A的核苷酸序列為序列表中序列I。5.權利要求1-4中任一 所述的環形載體A的制備方法，包括如下步驟: (1)用Xho I 酶切 pTet-On Advanced 質粒，回收 4.2kb 片段；用 Xho I 酶切 pTRE-Tight質粒，回收0....
【專利技術屬性】
技術研發人員：侯健，張娜，安曉榮，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：
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