一種同時檢測多種真菌毒素的方法技術

本發明專利技術提供了一種同時檢測多種真菌毒素的方法，該方法先對樣品進行提取凈化；凈化液經液相色譜串聯質譜技術檢測，最后通過同位素內標稀釋法準確測定農產品中多種真菌毒素。本發明專利技術的一種同時檢測多種真菌毒素的方法可以應用于玉米、小麥、香菇等植物中33種真菌毒素的同時檢測。本發明專利技術的方法具有耗時短，靈敏準確的特點，可適用于大批量樣品同時檢測。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術提供了，該方法先對樣品進行提取凈化；凈化液經液相色譜串聯質譜技術檢測，最后通過同位素內標稀釋法準確測定農產品中多種真菌毒素。本專利技術的可以應用于玉米、小麥、香菇等植物中33種真菌毒素的同時檢測。本專利技術的方法具有耗時短，靈敏準確的特點，可適用于大批量樣品同時檢測。【專利說明】—種同時檢測多種真菌毒素的方法
本專利技術涉及農產品安全檢測
，具體地說涉及。
技術介紹
由于人口和環境的壓力，全世界正面臨著巨大的食用農產品供給和安全的雙重挑戰。據聯合國糧農組織(FA0)資料，全球每年約有25%的農作物遭受真菌毒素的污染，約有2%的農作物因污染嚴重而失去營養和經濟價值，造成的直接和間接損失達數百億美元。谷類及其它農作物從田間到餐桌，產業鏈的各個環節均存在真菌污染的風險。這些真菌可能產生一系列具有不同化學結構的有毒次生代謝產物，稱為真菌毒素。真菌毒素污染已成為世界性公共安全問題，其污染的普遍性、嚴重性和防控的難度遠遠超過人們的實際感受。目前已發現的真菌毒素有300多種，對人類危害大的有幾十種，它們一般同時具有毒性強和污染頻率高的特點，其中包括黃曲霉毒素(81、82、61、62^1^2)、赭曲霉毒素(A、B)、玉米赤霉烯酮及其衍生物類毒素(α -玉米赤霉烯醇、β -玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α -玉米赤霉醇、β -玉米赤霉醇)、Α型單端孢霉烯族(Τ-2毒素、ΗΤ2毒素等)、Β型單端孢霉烯族(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌烯酮、隱蔽型脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)等。近年來我國出口的食用農產品特別是花生遭到了歐盟、日本等一些國家的技術壁壘，目前，歐盟和其它發達國家所限制食品中真菌毒素的種類正在不斷增加，且在各種農作物中的限量值一降再降，對我國的出口業務產生了很大的影響。出口的農作物由于真菌毒素超過輸入國限量標準而遭拒收或降低等級的現象常有發生。美國、歐盟及我國對不同食用農產品中各種真菌毒素 的限量標準規定如下:①美國規定食品中黃曲霉毒素Β的總量< 20 μ g/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量< 1000 μ g/kg,玉米赤霉稀麗的含量< 100 μ g/kg ;奶及乳制品中黃曲霉毒素Ml的含量^ 0.5 μ g/kg。②歐盟規定農產品中黃曲霉毒素B的總量< 4yg/kg，黃曲霉毒素B1的含量<2yg/kg，赭曲霉毒素A的含量< 3yg/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量< 1000yg/kg，玉米赤霉烯酮的含量< 50μ g/kg ;嬰幼兒食品中，黃曲霉毒素B的總量< 2μ g/kg，黃曲霉毒素B1的含量< 0.1 μ g/kg,黃曲霉毒素Ml的含量< 0.025 μ g/kg,赭曲霉毒素A的含量(0.5 μ g/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量< 15(^8/1^，玉米赤霉烯酮的含量< 20 μ g/kg ο③我國規定玉米、花生及其制品中黃曲霉毒素Β1的含量< 20 μ g/kg,赫曲霉毒素A的含量< 5 μ g/kg，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量< 1000 μ g/kg，玉米赤霉烯酮的含量(60 μ g/kg ;大米、植物油(除玉米油、花生油)中黃曲霉毒素B1的含量< 10 μ g/kg ;其它糧食、豆類、發酵食品中黃曲霉毒素B1的含量< 5 μ g/kg;嬰幼兒食品中黃曲霉毒素B1的含量< 5 μ g/kg,黃曲霉毒素Ml的含量< 0.5 μ g/kg ;鮮乳及乳制品中黃曲霉毒素Ml的含量< 0.5 μ g/kg。農產品安全檢測能力是衡量一個國家(地區)農產品安全水平的關鍵指標，在農產品安全控制系統中處于優先地位。目前，食用農產品中真菌毒素的檢測方法可以分為兩類:酶聯免疫分析法和色譜分析法。酶聯免疫吸附測定方法(ELISA)適用于大批量樣品的快速篩選，可以在較短的時間內完成大批量樣品的分析，具有操作簡便、快速、檢測成本較低等優點，但缺點是檢出結果有假陽性存在，且不能準確定量，每次只能對一種或少數幾種毒素進行檢測。色譜分析法包括薄層色譜掃描法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)以及LC、GC與質譜聯用法等。其中，TLC法在確證新發現的真菌毒素和檢測方法學研究等方面，具有一定的優越性，但是用薄層色譜法定量不夠準確，分離效率差，自1985年以后便很少用作真菌毒素的確認法。應用氣相色譜結合火焰離子化檢測器或質譜檢測器聯用技術對真菌毒素中的單端孢霉烯族類毒素(如T-2、D0N等)的檢測報道較多，但是對于其它高沸點或者熱不穩定的真菌毒素，需要經過復雜的衍生化過程，因而相對應用較少。總體上看，我國對食用農產品中真菌毒素的分析方法研究尚不完善，即使是研究相對廣泛的黃曲霉毒素，也主要針對黃曲霉毒素B1和M1，而對其它結構相似且同樣具有毒性的黃曲霉毒素，如黃曲霉毒素M2，則較少涉及。赭曲霉毒素、伏馬毒素等也是具有類似結構的一組化合物，受限于分析技術水平，目前報道的分析方法多數只測定其中的一類毒素。然而，來自全球和我國地方省市的調查研究表明，各類食用農產品，各個地區，各個季節均有真菌毒素污染，檢出率可高達70% -100%。污染農產品中的檢出毒素少則兩三種，多則十幾種，呈現多種真菌、多種毒素復合污染的特征，一旦檢出某種毒素，必定還有其他毒素存在。可見，一種食用農產品可以同時被多種真菌污染，從而產生多種真菌毒素。因此建立高通量、多殘留的真菌毒素分析方法非常有必要。然而，由于不同種類真菌毒素化學結構、色譜行為、光學特性相似，一般的分離方法無法將其在短時間內同時分離，而農產品的復雜成分產生的基質干擾作用，更使得多種真菌毒素同時高效檢測極具挑戰性。目前，尚缺乏能夠同時對不同食用農產品(玉米、小麥、香菇)中能夠涵蓋六大類主要真菌毒素多殘留檢測的分析方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，該方法為:先對樣品進行提取凈化；凈化液經液相色譜串聯質譜技術(LC-MS/MS)檢測，最后通過同位素內標稀釋法準確測定樣品中多種真菌毒素。該方法尤其適合同時檢測玉米、小麥和香菇中的多中國真菌毒素。具體的說，本專利技術的，包括如下步驟:①對樣品進行提取凈化:將樣品粉末中加入樣品含量的0.0001%-0.1%的同位素內標混合液(m/m)；然后加入樣品量的2-5倍的水(v/m)，浸泡5-lOmin后，超聲30_90min ；然后加入樣品量的2-5倍量(v/m)的含0.1%_2% (v/v)甲酸的乙腈溶液，渦旋混勻后，超聲30-90min ；再加入樣品重量的0.5-2倍(重量)的無水硫酸鎂和0.1-1倍(重量)的氯化鈉，力口入后劇烈震搖10-60s，超聲5-15min，在5000-15000r/min轉速下離心5_15min ；然后取離心上清液于30-50°C下氮氣吹干；殘渣用乙腈/醋酸銨水溶液溶解，過0.22 μ m的濾膜后，過濾液(即凈化液)待進樣分析；其中所用的同位素內標混合液為13C-AFB1、13C-0TA、13C-T2、13C-ZEN和13C_D0N的混合液；具體的同位素內標混合液為:50ngmL—1 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種同時檢測多種真菌毒素的方法，其特征在于該方法為：先對樣品進行提取凈化；凈化液經液相色譜串聯質譜技術檢測，最后通過同位素內標稀釋法準確測定樣品中多種真菌毒素。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：韓錚，武愛波，馮智紅，王建華，
申請(專利權)人：上海市農業科學院，
類型：發明
國別省市：