一種SjHSP90重組蛋白及其在血吸蟲病診斷及療效考核中的應用制造技術

一種日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1?所示。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】一種SjHSP90重組蛋白及其在血吸蟲病診斷及療效考核中的應用，屬于免疫學領域。本專利技術包括日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90重組蛋白的制備，SjHSP90重組蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。并進一步將該SjHSP90重組蛋白應用于血吸蟲病的診斷和療效考核。本專利技術首次提出將SjHSP90重組蛋白應用于血吸蟲病診斷，不僅可以用于診斷血吸蟲病，而且可以進行療效考核，具有廣闊的市場空間和較好的社會、經濟效益。【專利說明】—種SjHSP90重組蛋白及其在血吸蟲病診斷及療效考核中的應用
一種日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90重組蛋白及其在血吸蟲病診斷及療效考核中的應用，屬于免疫學領域。
技術介紹
血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病，目前全世界有74個國家流行血吸蟲病，7.79億人受到血吸蟲病的威脅，2億多人感染血吸蟲病。我國是日本血吸蟲病流行最嚴重的國家，主要流行于我國沿長江及其以南的十二個省、市、自治區，至2012年血吸蟲病人數仍然高達24萬。診斷是血吸蟲病防治領域的中心環節。常用的血吸蟲病原學診斷方法，由于其敏感性低、漏檢率高，操作繁瑣、人群依從率低等缺點，已不能滿足當前現場防治工作的需要。免疫診斷方法由于其快速、簡便，并具有較高的敏感性和特異性，在我國血吸蟲病防治工作中發揮了重要的作用。目前常用的免疫診斷方法均以檢測血吸蟲病人體內的抗體為依據，如間接血凝試驗(IHA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和膠體染料試紙條法(DDIA)等，這些方法具有較高的敏感性和較好的特異性，在現場得到了廣泛的應用，但由于流行區病人體內特異性抗體(主要為IgG)將在體內持續很長時間，即使在治愈后也不會很快消失，且在無再感染的情況下也將持續數年而不消失。因此發展有效療效考核的免疫診斷方法成為血吸蟲病防治工作中亟待解決的重大問題。 為解決當前血吸蟲病防治工作中療效考核這一難點問題-評價化療效果，較準確的確定化療對象，朱蔭昌等用SDS-PAGE和Western blot對日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原(SEA)進行了分析，發現血吸蟲蟲卵組分抗原(107-121kDa)具有較好的診斷價值和考核療效的作用，但是由于制備該組分抗原采用了從天然抗原SEA中提取的方法，制備方法復雜，得率低，限制了該組分抗原在現場查病中的大規模應用。本課題組在前期工作中采用蛋白組學方法分析該血吸蟲蟲卵組分抗原中的蛋白分子，篩選到SjHSP90重組蛋白分子，鑒定其具有診斷和療效考核價值。HSP90蛋白是廣泛存在于細胞內的一類高度保守的分子伴侶，通過維持其受體蛋白的穩定與活性而間接參與調控細胞內多條重要的信號傳導通路，其獨特的性質使其成為腫瘤診斷的標志物和治療的分子靶點。到目前為止，還沒有出現關于本專利技術SjHSP90重組蛋白應用于血吸蟲病診斷和療效考核的研究報道。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種含日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90基因的重組表達載體，該重組載體表達的SjHSP90重組蛋白，可用于血吸蟲病的診斷和療效考核。進一步目的在于提供一種以SjHSP90重組蛋白為基礎建立的血吸蟲病免疫診斷方法。為解決上述技術問題，本專利技術通過如下技術方案實現: 一種日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述SjHSP90重組蛋白的制備方法，將擴增的SjHSP90基因，雙酶切定向克隆到pET28a(+)載體上，經酶切鑒定和測序確認無誤，獲得重組質粒pET28a-SjHSP90 ;將重組質粒pET28a-SjHSP90傳化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，IPTG誘導目的蛋白表達，12%SDS-PAGE電泳顯示融合蛋白分子量82kDa，與預計分子量一致；破菌上清經金屬螯合柱親和層析進一步得到純化，SJHSP90重組蛋白純度達到95%。所述SjHSP90重組蛋白的的應用，用于診斷血吸蟲病。所述SjHSP90重組蛋白的的應用，用于血吸蟲病的療效考核。本專利技術的一個方面，優選的，所述表達載體為原核表達載體；更優選的，所述表達載體為原核表達載體pET28a(+)。在本專利技術的另一方面，提供了一種包含上述重組表達載體的大腸桿菌宿主細胞。在本專利技術的另一方面，還提供了一種日本血吸蟲SjHSP90重組蛋白的制備方法，包括如下步驟: 構建含SjHSP90基因的重組表達載體； 將所述重組表達載體轉化入大腸桿菌宿主細胞； 培養包含重組表達載體的大腸桿菌宿主細胞，并在合適條件下，誘導該重組表達載體表達SjHSP90重組蛋白。純化誘導表達的S jHSP90重組蛋白。本專利技術的另一方面，還提供了一種上述重組表達載體在制備診斷血吸蟲病的產品中的應用。本專利技術重組載體表達的SjHSP90重組可以作為診斷抗原，對血吸蟲病人或病畜進行診斷和療效考核。本專利技術的有益效果:本專利技術包括日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90重組蛋白的制備，SjHSP90重組蛋白其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。本專利技術首次提出將SjHSP90重組蛋白應用于血吸蟲病診斷，不僅可以用于診斷血吸蟲病，而且可以進行療效考核，具有廣闊的市場空間和較好的社會、經濟效益。【具體實施方式】實施例1:日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90基因的擴增 根據日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90基因序列設計引物，由上海生工生物工程公司合成， 引物 Pl:5’ -GCCATATGCC TGAACCAATG TCTACC-3 ’，引入酶切位點 Nde I ；引物P2:5’ - GCCTCGAGCT AGTCCACTTC CTCCATTCC-3’，引入酶切位點Xho I，經PCR擴增出全長SjHSP90基因(2160bp)。實施例2:SjHSP90的表達和純化 將成功擴增的SjHSP90基因，雙酶切定向克隆到pET28a(+)載體上，經酶切鑒定和測序確認無誤，獲得重組質粒pET28a-SjHSP90。將重組質粒傳化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，IPTG誘導目的蛋白表達，12% SDS-PAGE電泳顯示融合蛋白分子量82kDa左右，與預計分子量一致。破菌上清經金屬螯合柱親和層析進一步得到純化，SjHSP90重組蛋白純度達到95%以上，產量可達200mg/L。實施例3:日本血吸蟲病感染及治療的動物模型的建立 1)取健康新西蘭大白兔于腹部感染日本血吸蟲尾蝴200條，感染45d后，糞檢查到血吸蟲蟲卵確定感染后，用吡喹酮按150mg/kg體重進行治療，Iw后用相同劑量再復治一次；于感染前、感染后(治療前)和治療后每隔Iw的耳緣靜脈采血，直至治療后16w剖殺； 2)取Balb/c小鼠于腹部感染日本血吸蟲尾蝴20條，于感染第5周，糞檢查到血吸蟲蟲卵確定感染后，用吡喹酮按300mg/kg體重進行治療，Iw后用相同劑量再復治一次；于感染前、感染后(治療前)和治療后每隔Iw的尾靜脈采血，直至治療后16w剖殺。實施例4:重組蛋白SjHSP90_ELISA法的建立 采用正交試驗將得到的SjHSP90重組蛋白以不同濃度包被，ELISA法檢測不同稀釋度的感染兔血清，根據檢測結果選擇以陽性和陰性比值最大時的條件，即SjHSP90重組蛋白2 μ g/mL包被，1:100血清稀本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種日本血吸蟲熱休克蛋白SjHSP90重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1?所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王曉婷，戴洋，戴建榮，邢云天，曲國立，唐建霞，趙松，朱蔭昌，
申請(專利權)人：江蘇省血吸蟲病防治研究所，
類型：發明
國別省市：