一種牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法技術

一種牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，步驟包括：將待檢牛奶加入酪蛋白磷酸肽制成成10～100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液，脫蛋白后過陽離子交換樹脂柱脫鈣，將脫鈣后所得洗脫液過陽離子交換樹脂柱，除雜和富集，將收集液在溫度60～70℃，轉速為50～60rpm下真空旋轉蒸發，過膜后作為液相檢測樣品；然后進行液相檢測，按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。本發明專利技術在減少了實驗初期試劑、儀器等資金投入的同時，運用相對簡單高效的純化步驟進行操作，實現酪蛋白磷酸肽的分離，保證了定量精度，并有效去除其他蛋白質和脂類等雜志干擾，提高了最終檢測的靈敏度，有利于酪蛋白磷酸肽含量相對較低的樣品檢測。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】，步驟包括：將待檢牛奶加入酪蛋白磷酸肽制成成10～100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液，脫蛋白后過陽離子交換樹脂柱脫鈣，將脫鈣后所得洗脫液過陽離子交換樹脂柱，除雜和富集，將收集液在溫度60～70℃，轉速為50～60rpm下真空旋轉蒸發，過膜后作為液相檢測樣品；然后進行液相檢測，按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。本專利技術在減少了實驗初期試劑、儀器等資金投入的同時，運用相對簡單高效的純化步驟進行操作，實現酪蛋白磷酸肽的分離，保證了定量精度，并有效去除其他蛋白質和脂類等雜志干擾，提高了最終檢測的靈敏度，有利于酪蛋白磷酸肽含量相對較低的樣品檢測。【專利說明】
本專利技術屬于食品檢測
，尤其涉及一種酪蛋白磷酸肽(CPP)的液相檢測方法。
技術介紹
酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白為原料，通過生物技術制得，再經分離純化而得到的含有磷酸絲氨酸族的天然生物活性的多肽，可用于各種營養、保健食品中，能有效促進人體對鈣、鐵、鋅等二價礦物營養素的吸收和利用。德國和日本已把酪蛋白磷酸肽(CPP)定性為功能性食品。我國目前已廣泛的把酪蛋白磷酸肽(CPP)作為食品添加劑應用于嬰幼兒奶粉和保健食品中。雖然人們對酪蛋白磷酸肽(CPP)的功能組分、化學特點、生理功效等方面進行了廣泛深入的研究，但其在添加酪蛋白磷酸肽(CPP)的食品及保健品中的酪蛋白磷酸肽(CPP)檢測方面報道較少。據文獻報道，目前普遍采用乙醇沉淀法測定酪蛋白磷酸肽的含量，但該種方法只能檢測原料中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量大于10%的樣品，不能檢測牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量。在牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量檢測方面，存在一些難點問題，如牛奶中的蛋白質及一些鹽類成分會嚴重干擾測定結果。目前國內已有大公司將酪蛋白磷酸肽(CPP)添加在乳制品中，如內蒙古伊利實業集團股份有限公司等，但都沒有建立有效的評價酪蛋白磷酸肽(CPP)的檢測方法，因此急需找到一種能檢測牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法。基于目前的方法不能檢測牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量，已經不能滿足方便、快捷、靈敏度高的檢測方法的需求，建立一種高效液相色譜法測定牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法迫在眉睫，這也顯示出了高效液相色譜一定的優勢。
技術實現思路
本專利技術的目的:針對現有檢測酪蛋白磷酸肽(CPP)的技術中不適用于測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的不足，提供一種可有效地檢測出牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的高效液相色譜方法，該方法旨在將基本包括現有牛奶所可能涉及的各種主要酪蛋白磷酸肽(CPP)，使其能更加快速、靈敏、簡便地檢測酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量，以滿足實際工作的需要。本專利技術的目的是實現所述的利用高效液相色譜，測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，具體步驟為: (1)將待檢牛奶置于燒杯中，加入濃度為5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準溶液，混勻，加標成l(Tl00ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液； (2)脫蛋白，方法是取5?IOg酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料離心管中，加入5?IOg水，混勻后再加入5%。?1.5%三氯乙酸5?10g，漩渦混勻并超聲5?15min，然后以400(T4800rpm離心5?15min，離心后將離心管放入65?75°C的水浴鍋中水浴5?15min，再以400(T4800rpm離心5~15min，取上清液濾紙過濾后備用； (3)將預先處理好的陽離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3~5mL，用2~3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質，關閉活塞；將步驟(2)處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為1-2滴每秒；用水做洗脫劑，洗脫體積為廣2倍柱體積，收集洗脫液； (4)將預先處理好的陰離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3~5mL，用2~3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質，洗滌完成后、關閉活塞；將步驟(3)收集的洗脫液處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為廣2滴每秒；首先用2~3倍柱體積的水洗脫，除去雜質，然后用濃度為0.1-0.4mol/L HCl做洗脫劑，洗脫體積為2~3倍柱體積，收集洗脫液； (5)將收集液轉到濃縮瓶中，以濃縮溫度為6(T70°C，轉速為5(T60rpm，進行真空旋轉蒸發至f2mL，準確記錄濃縮后的體積，過膜后作為液相檢測樣品； (6)液相檢測:色譜柱DiamosilC18(2) 5u，250 X 4.6_，流動相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脫程序:從O到45min，流動相B濃度由5%梯度洗脫到35%，洗脫時段中均以流動相A補足余下的百分數，進樣量20 μ L，柱溫常溫，波長，215nm ； (7)按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。步驟(2)中，所述脫蛋白的方法也可以是:取5~10g事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5^10g水，混勻后再加入5%。~1.5%三氯乙酸5~10g漩渦混勻并超聲5~15min，然后以400(T4800rpm離心5~15min。取上清液濾紙過濾后備用。或取5~IOg事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5~IOg的水，混勻后再加入氯仿:正丁醇溶液(預先配成體積比4:1混合液)2.5~5mL，漩渦混勻并超聲5~15min，然后以400(T4800rpm離心5~15min，取出上層重復上述操作處理3次。取上清液濾紙過濾后備用。或取5~IOg事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5~IOg的水，漩渦混勻并超聲5~15min，將離心管放入65~75°C的水浴鍋中水浴5~15min，然后以400(T4800rpm離心5~15min。取上清液濾紙過濾后備用。步驟(3)中，所述陽離子交換樹脂為001X7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹月旨、羅門哈斯AMBERJET UP6040陽離子交換樹脂、三菱WK60L陽離子交換樹脂中的一種。步驟(4)中，所述陰離子交換樹脂為FPA98C1羅門哈斯離子交換樹脂、德國Lewatit M500陰離子交換樹脂,美國Amberlite IRA-400陰離子交換樹脂、阿拉丁陰離子交換樹脂中的一種。本專利技術方法的檢測限為大約10 μ g/mL (信噪比≤3)，回收率在85%~105%之間。本專利技術的檢測方法的主要特點: 本專利技術方法靈敏度高、準確度和精密度好，專屬性及確證性可靠，而且非常簡便并可易于實際檢測應用，且可非常好地滿足實際檢測中的需要。采用高效液相色譜對牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)檢測的方法，目前尚未見有相應的報道。本專利技術優點為:本專利技術建立了用高效液相色譜檢測牛奶實際樣品中酪蛋白磷酸肽(CPP)的定量分析方法，減少了實驗初期在實驗試劑、儀器設備等方面的資金投入的同時，運用相對簡單高效的純化步驟進行操作，實現酪蛋白磷酸肽(CPP)的分離，保證了定量精度，并有效去除其他蛋白質和脂類等雜志干擾，提高了最終檢測的靈敏度。方法的檢出限為15 μ g/mL,有效地確保實驗數據的準確度，有利于酪蛋白磷酸肽(CPP)含量相對較本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：曹庸，李雙祁，劉飛，彭維，郭斌，吳成順，
申請(專利權)人：廣州綠萃生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：